粘多糖贮积症Ⅱ型的酶学检测,产前诊断及临床分析.docVIP

编辑老师，您好！ 按照贵刊修回的稿件要求，已进行了如下的修改：（文章中修改的部分均为红色字体标明） 文章的题目已做改动，邮编，城市，及通讯作者的资料也已补充； 文章中的计量单位已按照要求修改； 已删除表1及2，重要内容改为文字描述； 参考文献已做增补，因粘多糖贮积症为一种较罕见的遗传代谢性疾病，粘多糖贮积症Ⅱ型在我国相对多见，由于基因诊断较为复杂且诊断率不能达到100%，故酶学诊断是该病的金标准，但酶学诊断在国内外开展时间均不长，我们检索了medline中与酶学诊断相关的文献很少，近几年的文献不多。 非常感谢您的宝贵意见！！ 张雪梅 粘多糖贮积症Ⅱ型的酶学检测、产前诊断及临床分析 张雪梅，刘之英，陈新莲，刘洪倩，谢良玉，魏杨君，刘珊玲，王 和（610041 成都 四川大学华西第二医院妇产科产前诊断中心、遗传实验室、教育部妇儿疾病与出生缺陷重点实验室） [关键词]粘多糖贮积症Ⅱ型（MPSⅡ）；X 连锁隐性遗传病；荧光酶学检测；诊断；产前诊断 [通信作者] 王和，电话：（028）；E-mail：wanghe_cd@126.com；刘珊玲，电话：（028；E-mail：sunny630@126.com。 [基金项目] 十一五国家科技支撑计划：重大出生缺陷和遗传病的防治研究重大遗传病产前筛查、诊断综合技术体系研究1：110，000MU-αIdoA-2S、LEBT 购自MOSCERDAM。氯化铵，碳酸氢钾，乙二胺四乙酸钠均为国产分析纯。 1.1.3 96孔板 本实验室使用的是丹麦Nunc公司的96孔板条。 1.1.4 荧光检测仪 本实验室采用Wallec公司的Victor2. 1.1.5 超声细胞粉碎机 宁波新芝科器研究所JY92-Ⅱ 1.2 方法 1.2.1 试剂配制 底物：配制0.1mol/L Na-acetate/0.1mol/L acetic acid buffer pH5.0， 溶解MU-αIdoA-2S成1.25mmol/L MU-αIdoA-2S。 红细胞裂解液 155mmol/L氯化铵、10mmol/L碳酸氢钾、1mmol/L乙二胺四乙酸钠（EDTA），PH值7.4。 1.2.2 待测样本准备 ①白细胞：抗凝外周血10ml 加红细胞裂解液40ml混匀，4℃条件下放置30min后，1800r/min离心10min，弃上清；再加10ml红细胞裂解液清洗白细胞，1800r/min离心10min，弃上清，此步骤视裂解效果可重复。加双蒸水悬浮白细胞，超声破碎细胞，离心后取上清检测蛋白浓度后备用。 ②血清：外周血10ml离心后取血浆。 ③羊水细胞标本：于18-24周抽取羊水10ml，培养后收获细胞，用PBS反复洗涤3次，加双蒸水悬浮细胞，超声破碎细胞，离心后取上清检测蛋白浓度后备用。 1.2.3 酶活性检测 96孔板中每孔加入10μl细胞上清液（或血浆）及20μl底物，混匀后37℃孵育4h，加入磷酸盐/柠檬酸缓冲液20μl及LEBT10μl，37℃孵育24h，加NaHCO3/ Na2CO3缓冲液终止反应，用荧光检测仪检测其荧光强度，激发波长355μm，发射波长460μm。 1.3 检测对照设定 每一检测样本均设立复孔。每次检测均设正常酶活性标本对照。对每个待测样本均同时检测2种不同的酶活性（包括待测酶在内）。 1.4 计算酶活性 对每一次检测均同时做标准相对分子质量的4-甲基伞形酮荧光量测定，以计算出检测样本的酶活性。检测单位为蛋白质纳摩尔数，即（nmol/h/mg），如为血浆则检测单位为(nmol/h/ml）。 2. 结果 10例为酶学诊断，10例患儿中9例为男性，1例为女性；10例中有8例检测到无酶活性，其临床表现均很典型并严重；这例女性患儿有典型的临床表现，检测了MPS其它酶学亚型均为正常，进行MPSⅡ的酶学检测，结果显示无酶活性；2例患儿检测到酶活性极低，分别为0.64 nmol/4h/mg及0.85nmol/4h/mg，均明显低于正常酶活性。我们检测了19例正常人MPSⅡ酶活性参考范围为（21～70 nmol/4h/mg）。 7例酶学产前诊断，5例为正常胎儿；诊断为患病胎儿2例，均进行了引产手术，其中1例第一次产前诊断为患病胎儿进行了引产，第二次产前诊断为正常胎儿，所有酶学诊断正常的胎儿出生后均进行了随访，至今均未见异常，最长随访时间为5年，最短随访时间为10个月。 每个病例均同时进行了目标酶（MPSⅡ）及对照酶活性的检测，对