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影响光学显微镜成像的若干因素 影响光学显微镜成像的若干因素 夫琅和费圆孔衍射 艾里斑 点扩散函数 瑞利判据 夫琅和费圆孔衍射 光波绕过障碍物传播的现象称为光的衍射。衍射后所形成的明暗相间的图样称为衍射图样 在夫琅和费圆孔衍射中，光源、观察屏与障碍物之间的距离都是无限远，障碍物为一直径为R的圆孔（显微镜的物镜可与该障碍物相当） 夫琅和费衍射图样的观察 利用两块会聚透镜，一块放在障碍物前，将点光源发出的光变为平行光，另一块放在障碍物后，使经过障碍物后的衍射光在透镜的焦平面上成像 艾里斑 由圆孔衍射图样的第一暗环包围的中央亮斑称为艾里斑（Airy disc）。理论计算表明，艾里斑的光强占整个入射光强的84%。艾里斑的半径为 其中f是透镜L2的焦距， 是入射光的波长，R是圆孔的半径。可以看到，孔径R越小，或者波长越大，衍射现象越明显 圆孔衍射现象是显微镜成像过程中不可避免的现象，它对显微镜的分辨率将产生重大的影响 点扩散函数 从理想情况看，点光源通过一个无缺陷的光学系统后应在像平面获得对应的点像，但是由于圆孔衍射现象的存在，点光源在焦平面上的成像实际为一个光斑。 为了能够对实际光学系统的性质做出正确描述，将一个直径为无限小的理论点光源通过光学系统后的成像性质用点扩散函数（point spread function，PSF）表示 点扩散函数 一般而言，点扩展函数是不可能精确得到的。由于光学系统的聚焦不良、样品与光学系统之间的相对运动等引起的图像模糊是影响系统成像质量的主要原因，因此根据图像降质（退化）物理过程的先验知识，可以估计出成像系统的点扩展函数 点扩散函数 因为一个成像系统对函数的冲击响应能够反映该系统具有的衍射、像差以及一切造成光能量扩散的固有性质，所以输入为函数时系统的输出函数即为成像系统的点扩散函数 瑞利判据 点扩散函数对光学系统的分辨率有着重要的影响 利用显微镜观察样品，其图像可以看成有许多不同亮度、不同位置物点的像所组成。每个物点所成的像实际上是一定大小的艾里斑，物点靠得太近，物点所成的像彼此重叠，样品的细节变得模糊不清 衍射现象限制了光学系统分辨细节的能力 瑞利判据 物理学家瑞利（Rayleign）指出，A衍射图样的中央最大光强度与B衍射图样的第一最小光强度重合所确定的两物点间的距离就是光学系统所能分辨的两物点间的极限距离。称这个极限距离为瑞利判据 瑞利判据 瑞利判据 随着两物点距离的缩小，光学系统由于衍射现象以及总光强的叠加最终不能分辨出相应的物点 光学显微镜成像的数学模型 显微镜成像的数字模型 图像复原 由观察图像复原理想图像，在数学上来说是一个逆向问题。如果显微镜系统的点扩散函数PSF是已知的话，则可以通过逆向运算，复原理想图像 去卷积 去模糊法（deblurring） 最近邻域法 图像复原法（image restoration） 约束迭代法 反向滤波法 去卷积图像 约束迭代法（constrained iterative） 首先实现对理想图像的最初估计，一般是原始图像自身。用估计图像和点扩散函数进行卷积，获得模糊的估计图像 将该图像与最初的原始图像进行比较。比较结果用于确定误差尺度，它将描述模糊的估计图像与原始图像的相似程度 利用误差尺度，在减少误差的前提下修改估计图像。 约束迭代法（constrained iterative） 用修改后的估计图像与点扩散函数进行卷积，计算新的误差尺度 随着算法的进行，每一次确定的误差标准并非最小，进行新的估计图像的再模糊过程，重新计算误差尺度 整个迭代过程一直重复至误差尺度为最小或达到预先定义的阈值时结束 最终的恢复图像就是在迭代结束时的对理想图像的估计值。 反向滤波法（reverse filter） * ? ? ? 将显微镜中图像的形成看作是一个线性过程，在这个过程中，样品上的每一点与物镜的点扩散函数进行卷积，从而获得一幅观察图像。 其中 表示观察图像， 表示理想图像， 表示显微镜系统的点扩散函数。 *