非对称二甲基精氨酸水解酶的表达纯化及其酶学性质的研究.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１３，３３（４）：４６５３ 非对称二甲基精氨酸水解酶的表达纯化 及其酶学性质的研究 １ ２ １ １ 赵志敬 　王学忠 　沈文婷 　胡　广 （１北大工学院绍兴技术研究院生物工程中心　绍兴　３１２０００） （２绍兴科锐捷生物科技有限公司　绍兴　３１２０３０） 摘要　非对称二甲基精氨酸水解酶（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｒｇｉｎｉｎｅＤｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ，ＤＤＡＨ）是酶学循环 法检测早期急性心肌梗塞（ａｃｕｔｅｍｙｏｃａｒｄｉａｌｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ，ＡＭＩ）的生物标记物———非对称二甲基精氨 酸（ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃｄｉｍｅｔｈｙｌａｒｇｉｎｉｎｅ，ＡＤＭＡ）的重要工具酶。为获得高活性ＤＤＡＨ，从绿脓杆菌的基因 组中扩增目的基因，构建高效表达ＤＤＡＨ的重组菌Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ｐＥＴ２８ａＤＤＡＨ）。该菌的可溶 性ＤＤＡＨ表达量达１００ｍｇ／Ｌ，经超声破碎后的上清液通过镍柱纯化，可获得纯度达到９５％以上的 重组ＤＤＡＨ。Ｑ柱的精制可提高它的稳定性，使其能够在常温下长期保持酶活。该重组酶的单位 酶活，Ｋｍ值和Ｖｍａｘ分别为０．５Ｕ／ｍｇ，３．０４ｍＭ和８．０７ｍＭ／ｈ。最适反应温度和ｐＨ分别为３５℃ 和ｐＨ＝６，在１０℃～４０℃和ｐＨ５．０～ｐＨ９．０的范围内稳定。该重组酶可形成多聚体，但并不影响 酶活。最后，利用发酵罐扩大生产规模，有望进行克级生产，为新型ＡＤＭＡ检测试剂盒的开发和 药物筛选模型提供材料基础。 关键词　ＤＤＡＨ　ＡＤＭＡ　蛋白纯化　酶学性质 中图分类号　Ｑ７８６ ［１３］ 　　ＡＤＭＡ是一种心血管疾病的生物标记物 。该 原理如图１所示：ＤＤＡＨ催化组织样本中的ＡＤＭＡ水 化合物在胞内生成后会转移至血浆内，可抑制精氨酸 ［１３］ 解，生成Ｌ瓜氨酸（Ｌｃｉｔｒｕｌｌｉｎｅ） ；Ｌ瓜氨酸在瓜氨酸 产生一氧化氮，而ＮＯ是对内皮细胞及心血管有益的物 水解酶（ｃｉｔｒｕｌｌｉｎｅｈｙｄｒｏｌａｓｅ）和鸟氨酸氨甲酰转移酶 ［４５］ 质 。研究表明，ＡＤＭＡ作为危重病的危险因子，其 （ｏｒｎｉｔｈｉｎｅｃａｒｂａｍｏｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＯＣＴ）及其底物组成的 体内的表达水平对急性心肌梗塞，动脉粥状硬化、糖尿 酶循环反应系统中不断循环反应，从而大大地提高反 病以及肝肾功能衰竭等疾病的发生、发展和转归具有 应灵敏度，Ｌ瓜氨酸生成量与样本中的ＡＤＭＡ含量成 重要的预测价值和临床意义［６９］。因此，快速准确检测 正比，通过测循环酶反应体系中氨的生成速率，就可以 ＡＤＭＡ含量方法的建立对基础研究和临床诊断都有非 ［１４］ 达到测定样本中ＡＤＭＡ的目的 。该方法可直接应 常重要的意义。 用于目前医院检验科广泛使用的临床生化自动分析 　　目前，ＡＤＭＡ最主要的检测方法包括质谱法，高效 仪，无需额外的特别处理、操作简便、灵敏度高且成本 液相色谱法和酶联免疫法，但这些检测方法存在测定 低廉，可实现快速、大流量的样本测试，使 ＡＤＭＡ成为 程序复杂、耗时、样品需要预处理以及测试仪器价格昂