痰标本的筛选.docVIP

微生物实验一 （一）痰标本的筛选 实验原理 通过肉眼和显微镜观察痰液标本的大体性状和微观细胞组分判断标本采集是否合格以便进一步病原学检查。 试剂器材 痰液标本、载玻片、100ul移液枪、枪头、玻璃铅笔、煤气灯、火柴、革兰染液、吸水纸、显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸。 操作步骤 （1）肉眼观察并记录标本相关性状：目测黄色、灰色、血性、铁锈色，浑浊、稠厚，呈现团块状的标本为合格标本；而无色透明、有灰白片状物或黑色小点，有明显食物渣滓、纸屑灰尘的为不合格标本。2cm×2.5cm大小的区域，用移液枪吸取100ul痰液均匀涂抹在该区域内形成一个厚薄适宜的痰膜，在室温下自然干燥直至无湿痕。 ③打开煤气灯阀门，用火柴点燃煤气灯，痰涂片干燥后手持玻片使痰膜部分在火焰外焰迅速穿过火三次完成涂片固定，关煤气阀门。 ④初染：结晶紫染1分钟。 自来水冲洗。 　媒加碘液覆盖涂染约1分钟。 　水洗，用吸水纸吸去水分。 　加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，0秒后水洗，吸去水分。 红染0秒后，自来水冲洗。干燥，镜检。在显微镜在显微镜在显微镜? 白细胞 上皮细胞 A ＞25/LP ＜10/LP B ＞25/LP ＜25/LP C ＜10/LP ＞25/LP A、B为合格标本，可进入下一步程序；而脓细胞10/LP或鳞状上皮25/LP的本为不合格标本，应拒收。 A类标本，箭头所指的都是白细胞，可见白细胞大约在40～50个，如下图： B类标本，左箭头所指的是白细胞，右箭头所指是上皮细胞，白细胞大约在40～50，上皮细胞26～30个，如下图： C类标本，箭头所指的是上皮细胞，可见上皮细胞30～35个，如下图： 革兰染色时染液量应以覆盖菌膜为宜，经革兰染色后，细菌染色性可分为2种，革兰阳性菌呈紫色，革兰阴性菌呈粉红色；形态主要有球形、杆形和弧形，记录观察结果时需记录细菌的染色性、形态、排列方式（常见的有散在、葡萄堆状、成对、链状等。） （二）细菌分离培养技术 实验原理 将标本中混杂的多种细菌分离成单个细菌，在培养基表面各自生长繁殖形成单个细菌集团即菌落，以获得纯培养，为进一步鉴定细菌提供条件。 试剂器材 痰液标本、无菌棉签、血平板、记号笔、煤气灯、火柴、接种环、35℃孵箱。 操作步骤 （1）在血平板底部用记号笔做好标记，包括标本号、学号。点燃煤气灯。 （2）右手持无菌棉签充分沾取痰液，标本左手持平皿，用拇指小指无名指固定，并将平板边缘稍微提高呈30°-45°角，至酒精灯前上方5-6cm，先在平板一端涂布，然后快速大幅度左右来回以密而不重叠的曲线形式作连续划线接种，该部分占平板1/3区域，使用过的棉签放回试管中。 （3）将接种环火焰灭菌，待冷却后与上一区交叉接触3-4次再做数次划线，然后循环该环节2次，使平板呈现4区部分重叠的接种区域，各区线间保持一定距离，密而不重，注意最后一区不要和第一区重合，将平板扣入平皿盖，置35℃培养18-24h观察结果。（如图） （三）细菌生化鉴定技术 实验原理 由于细菌所具有的酶系统各不相同，对营养物质的分解能力亦不一致，因而其代谢产物不同。根据此特点，利用生化试验的方法来检测细菌对各种基质的代谢作用及其代谢产物，从而鉴别细菌。 试剂器材 待检标本（血平板）、玻璃铅笔、记号笔、煤气灯、火柴、接种环、接种针、载玻片、革兰染液、生理盐水、吸水纸、显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸、氧化酶、滤纸片、KIA、MIU、试管架、35℃孵箱。 操作步骤 （1） 待检标本大体形态肉眼观察：观察经过24h，35℃需氧培养的血平板，从颜色、形状、大小、湿润度、透明度、溶血情况等角度描述并记录单个细菌菌落的生长情况，从细菌形态和在平板上生长菌落所占相对比例判断哪种细菌为疑似引起下呼吸道感染的病原菌，并做简要说明。 （2）革兰染色：取洁净载玻片一张，在玻片一端用玻璃铅笔做好标记，包括标本号、学号，在玻片正中用玻璃铅笔画一个约1cm×1cm大小的区域，滴半滴生理盐水于其中。用经过火焰灭菌并冷却的接种环从血平板上挑取单个灰白色中等大小光滑湿润不透明的圆形凸起菌落均匀涂抹在该区域内形成一个厚薄适宜的菌膜，在室温下自然干燥直至无湿痕，痰涂片干燥后手持玻片使痰膜部分在火焰外焰迅速穿过火三次完成涂片固定。 初染：结晶紫染1分钟。 自来水冲洗。 　媒加碘液覆盖涂染约1分钟。 　水洗，用吸水纸吸去水分。 　加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，0秒后水洗，吸去水分。 红染0秒后，自来水冲洗。干燥，镜检。10s内观察颜色变化，变紫色为阳性，不变为阴性。双糖铁(KIA)用针穿刺，取单个菌落，穿刺至底部3-5mm处，然后在斜面上往复划线。放35度培养18-24小时。 微生物实验二 （一）细菌分离