优质课土壤中分解尿素的细菌的分离与计数.ppt

* 课题背景 1、尿素的利用 尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。 2、细菌利用尿素的原因 土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶 CO(NH2) 脲酶 + H2O + CO2 NH3 3、课题目的 ①从土壤中分离出能够分解尿素的细菌 ②统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌 一.研究思路 ㈠.筛选菌株 ㈡.统计菌落数目 ㈢.设置对照 1、实例： 启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。 原因：因为热泉温度70～800C，淘汰了绝大多数微生物，只有Taq细菌被筛选出来。 DNA多聚酶链式反应(PCR)是一种在体外将少量DNA大量复制的技术，此项技术要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。 科学家是从水生耐热细菌Taq中分离到耐高温的TaqDNA聚合酶。 Taq细菌是美国科学家鲁克在一个热泉中发现 要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点（微生物的生长条件）， 方法： ⑴阻止或抑制其他微生物不能生长 ⑵提供有利于该菌生长的环境， 结果：培养一定时间后，该菌数量上升，再通过平板稀释等方法对它进行纯化培养分离。 2、实验室中微生物的筛选原理： 人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。 15.0g 琼脂 1.0g 尿素 10.0g 葡萄糖 0.2g MgSO4`7H2O 2.1g NaH2PO4 1.4g KH2PO4 3、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基： ①从物理性质看此培养基属于哪类？ 固体培养基 ②在此培养基中哪些作为碳源、氮源？ 碳源：葡萄糖、尿素 氮源：尿素（唯一的氮源） ③这种培养基对微生物是否具有选择作用？如果有，如何进行选择的？ 有选择作用 该培养基中是以尿素为唯一氮源，只有能够利用尿素的微生物才能够生长（只有合成脲酶的微生物，才能分解尿素） 。经过培养，能选择出分解尿素的微生物 加入青霉素的培养基 杀死细菌等，分离酵母菌、霉菌等真菌 加入高浓度食盐的培养基 杀死多种微生物，分离出金黄色葡萄球菌 不加氮源的无氮培养基 分离出自生固氮菌（非固氮菌因缺少氮源被淘汰） 不加含碳有机物的无碳培养基 分离出自养型微生物（异养微生物因缺少有机物被淘汰） 加入抗生素的培养基 利用抗生素抗性基因作标记基因，选择分离出导入目的基因的工程菌 选择培养基 在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。 1.间接计数法（活菌计数法） ⑴原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。 ⑵常用方法：稀释涂布平板法（稀释涂布平板计数法）。 每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M 其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。 ㈡.统计菌落数目 注意：平板划线法只能纯化该种微生物，并不能用来准确统计样品中活菌的树数目，但是稀释涂布平板法既能纯化该种微生物，又能用来准备统计数目 第一位同学只涂布了一个平板，没有设置重复组，因此结果不具有说服力。 第二位同学考虑到设置重复组的问题，涂布了3个平板，但是，其中1个平板的计数结果与另2个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值 实验启示 在设计实验时，一定要涂布至少3个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验。 注意事项 ①设置重复组，增强实验的说服力与准确性。 ②为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。 ③当菌落数目稳定时，才能进行计数，否则，会因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。 ④统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，因此，统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。（因此统计结果一般用菌落数而不用活菌数来表示） 思考：想一想，如何根据平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数？ 统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好统计三个平板，计算出平板菌落数的平均值，然后按课本旁栏的公式进行计算 （三）设计对照 设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。 一是由于土样不同，二是由于培养基污染或操作失误 一种方案是可以由其他同学用与A同学一样的土样进行实验，如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存