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GGB 中华人民共和国国家标准 农业部953号公告-5-2007 转基因动物及其产品成分检测 促生长转ScGH基因鲤鱼定性PCR方法 Detection of genetically modified animals and derived products Qualitative PCR method for growth promoting ScGH transgenic common carp 2007-12-18发布 2008-03-01实施 中华人民共和国农业部 发 布 前 言 本标准由中华人民共和国农业部科技教育司提出。 本标准归口全国农业转基因生物安全管理标准化技术委员会。 本标准起草单位：农业部科技发展中心、中国水产科学研究院黑龙江水产研究所。 本标准主要起草人：梁利群、历建萌、孙效文、沈平、闫学春、常玉梅。 本标准为首次发布。 转基因动物及其产品成分检测 促生长转ScGH基因鲤鱼定性PCR方法 1 范围 本标准规定了转ScGH基因促生长鲤鱼基因特异性定性PCR检测方法。 本标准适用于转ScGH基因促生长鲤鱼中转基因成分的定性PCR检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准。然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用引用文件的必威体育精装版版本。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本适用于本标准。 NY/T 672 转基因植物及其产品检测 通用要求 GB/T 18654.2-2 养殖鱼类抽样检测 第2部分：抽样方法 SC/T 3016-4 水产品抽样方法 3　术语和定义DNA分子量标准浓度为10 mmol/L的dATP、dTTP、dGTP、dCTP四种脱氧核糖核苷酸等体积。 5.5 酚:氯仿:异戊醇（25:24:1,v/v）。 5.6 琼脂糖。 5.7 10 g/L溴化乙锭溶液溴化乙锭（EB） 注：有致癌作用，配制和使用时应戴一次性手套操作。称取80 g氢氧化钠（NaOH）， mL水中完全溶解加水定200 mL。500 mmol/L乙二铵四乙酸二钠溶液pH 8.0）：称取18.6 g乙二铵四乙酸二钠（EDTA-Na2），加入70 mL水中，再加入溶液，加热溶解后，冷却至室温，用调pH至8.0，水定容100 mL。在103.4 kPa（121℃）条件下灭菌20 min。 1 mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液pH 8.0）：称取121.1 gTris）溶解于800 mL水中，用盐酸调pH至8.0，水定容至1 L。在103.4 kPa（121℃）条件下灭菌20 min。1 mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液pH 7.5）：称取121.1 gTris）溶解于800 mL水中，用盐酸调pH至.5，水定容至1 LTE缓冲液（pH 8.0）10 mL 三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液（）和2 mL 乙二铵四乙酸二钠溶液（），水定容至1 L。在103.4 kPa（121℃）条件下灭菌20 min。TE缓冲液（pH .5）10 mL 三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液（）和2 mL 乙二铵四乙酸二钠溶液（），水定容至1 L。在103.4 kPa（121℃）条件下灭菌20 min。乙二铵四乙酸二钠称取250g溴酚蓝，加10 mL水，在室温下溶解；称取250g二甲基苯腈蓝，用10 mL水溶解；称取50 g蔗糖，用30 mL水溶解，混合三种溶液，水定容至100 mL，在4℃下保存。-盐酸溶液（）乙二铵四乙酸二钠溶液（）水定容至1 L容μmol/L。 6 仪器 6.1 PCR扩增仪6.2 电泳槽、电泳仪等电泳装置6.3 凝胶成像系统紫外透射仪6.4 重蒸馏水发生器6.5 其他分子生物学实验室仪器设备μL DNA裂解液，50℃消化过夜，加入等体积的酚:氯仿:异戊醇溶液，震荡混匀，室温2,500 g离心5 min，吸取上层水相，重复抽提二次。将上清液转入透析袋中进行数次透析，直到透析液OD2700.05，将透析袋中的液体转入离心管中，加入无DNA的RNA酶，终浓度为100 mg/L，37℃温浴30 min。先用冰预冷的无水乙醇沉淀，4℃，15,000 g离心20 min，弃上清液，用70%乙醇洗涤沉淀，15,000 g离心，2-3次，室温干燥后加TE(pH 8.0)溶解，并保存于4℃备用。 7.3.2 DNA溶液纯度的测定和保存 将DNA适当稀释，测定并记录其在260 nm和280 nm的紫外分光吸收率，以一个OD260值相当于50