丙型肝炎病毒核酸扩增检测标准操作规程.docVIP

丙型肝炎病毒(HCV)核酸扩增(PCR) 荧光定量检测标准操作程序 一、目的：明确丙肝病毒核酸定量检测的操作规程，指导检验人员正确进行丙肝病毒核酸定量的检测,保证检测结果及时可靠。 三、职责：实验操作人员应严格按操作规程进行实验。 四、检测 1. 来源：上海科华生物工程股份有限公司HCV核酸扩增荧光检测试剂盒〔国药准字S2000063〕。 规格：人份/盒。 试剂盒组成：ul×1支 含有一对引物和dNTP的溶液 酶混合物 180ul×1支 含有Taq酶、逆转录酶和RNA酶抑制剂的溶液 荧光探针 20ul×1支 含有荧光探针的溶液 对照品 阴性对照 250ul×1支 含有0.05% NaN3的HCV RNA阴性的混和人血清 强阳性对照 250ul×1支 含有约2×106 IU/ml的HCV基因片段的非传染性体外转录RNA 弱阳性对照 250ul×1支 含有约2×104 IU/ml的HCV基因片段的非传染性体外转录RNA 工作标准品① 250ul×1支 含有适量的HCV基因片段的非传染性体外转录RNA 工作标准品② 250ul×1支 含有适量的HCV基因片段的非传染性体外转录RNA 工作标准品③ 250ul×1支 含有适量的HCV基因片段的非传染性体外转录RNA 工作标准品④ 250ul×1支 含有适量的HCV基因片段的非传染性体外转录RNA 工作标准品①～④的参数和强、弱阳性对照的定值允许范围根据批号不同而不同。详见试剂盒的说明书附页。 六、仪器：Roche LightCycler 七、操作程序 1、样本处理（本处理区）℃加热5分钟，使试剂瓶内的结晶全部溶解。吸取1ml裂解液加到助沉剂的试剂瓶中，用吸嘴搅动，混匀后全部吸回到裂解液瓶中，混匀后备用。 1.1.2 在去抑制剂的试剂瓶中加入700ul洗脱液，用吸嘴搅动，溶解后混匀备用。 1.1.3 在洗涤液A的瓶子中加入6ml无水乙醇，颠倒混匀后备用。 1.1.4 在洗涤液B的瓶子中加入16ml无水乙醇，颠倒混匀后备用。 1.2 病毒RNA提取 1.2.1取n个0.5ml离心管（n＝标本数量+阴性对照、强阳性对照、弱阳性对照和4个工作标准品），做好标记后分别加入100ul已混有助沉剂的裂解液。 1.2.2分别用带滤芯吸嘴加入100 ul需处理的血清或血浆标本和对照品，用带滤芯吸嘴反复吹打5次。 1.2.3 再分别用带滤芯吸嘴加入20 ul 去抑制剂，盖上管盖，振荡混匀，离心数秒，置70℃反应10分钟。 1.2.4 离心数秒，用带滤芯吸嘴加入110ul无水乙醇，振荡混匀，离心数秒。 1.2.5 将做好标记的核酸提取柱插入连接管后，固定在负压装置上，将步骤2.4中的所有液体小心移入核酸提取柱。注意不要将液体溅入其它样品的核酸提取柱内。 1.2.6 开启负压，让核酸提取柱内的液体全部抽干。 1.2.7 在每个核酸提取柱内加入500ul洗涤液A，开启负压，让核酸提取柱内的液体全部抽干。 1.2.8 在每个核酸提取柱内加入500ul洗涤液B，开启负压，让核酸提取柱内的液体全部抽干。 1.2.9从连接套管上取下核酸提取柱，将其放入无RNA 酶的2ml离心管中，盖上管盖，14000rpm离心1分钟。 1.2.10将提取柱放入一新的2ml离心管中（确保采用无RNA酶的离心管），小心将50ul洗脱液加在柱面中央，静置1分钟。 1.2.11盖上管盖，10000rpm离心1分钟，取2ml离心管中的收集液12.5ul 做PCR反应模板。 2、RT―PCR试剂准备（PCR前准备区进行） 从试剂盒中取出PCR主反应液、酶混合物和荧光探针，室温下融化后离心数秒，按照待扩增标本数量X ，取PCR主反应液：酶混合物：荧光探针=7∶5∶0.5混合，加入一适当体积离心管中，充分混匀后离心数秒，分装至PCR毛细反应管中，每管12.5ul，将装有PCR反应液的毛细反应管转移至标本处理区。 3、加样（本处理区） ul已处理好的标本（标本处理步骤2.11离心管中的洗脱液）。 3.2 盖上管盖，离心数秒后转移至扩增检测区。 4、PCR扩增（扩增检测区） 循环设℃) Hold Time (min:sec) Slope (℃/sec) Acquisition Mode 1 1 50 25