第四章 抗菌药物敏感试验(上).pptVIP

第四章 抗菌药物敏感试验 抗菌药物敏感试验（AST）：指体外测 定药物抑制或杀死细菌能力的试验。 AST意义： 预测抗菌治疗的效果 指导临床选择用药 进行耐药菌监测 评价新药的效果 第一节 抗菌药物敏感性试验 一、抗菌药物选择 A组 常规首选药物，全部报告 B组 医院感染重要药物，选择性报告 C组 用于A、B组耐药或过敏的患者 U组 用于尿道分离细菌 O组 一般不允许常规试验并选择的药物 二、常用方法 1.纸片扩散法—K-B纸片法 2.稀释法 肉汤稀释法：宏量、微量 琼脂稀释法 3.抗菌药物梯度法—E-test 4.自动化仪器法 二、纸片扩散法（K-B法） （一）实验原理 将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试 菌的琼脂平板上，纸片中所含有的药物溶解后向 周围扩散形成递减的梯度浓度，在纸片周围抑菌 浓度范围内测试菌的生长被抑制，从而形成无菌 生长的透明圈即为抑菌圈。抑菌圈的大小反映测 试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌 的MIC呈负相关 （二）培养基和抗菌药物纸片 1. 抗菌药物纸片 专用药敏纸片：直径-6.35mm 吸水量-20微升 2. 培养基 水解酪蛋白（M-H）琼脂，琼脂厚度4mm 链球菌属、肠球菌属、脑膜炎奈瑟菌：加5%脱纤维羊血 嗜血杆菌属：Ⅴ、Ⅹ因子 3.菌液比浊管-0.5麦氏比浊管的制备： 1%氯化钡：0.5ml 1%硫酸溶液：99.5ml 625nm处吸光度值为0.08~0.10 ，相当于1.5×108cfu/ml 用前混匀 有效期：6个月 （三） 实验方法 1.校正菌液浓度 无菌挑取孵育16～24h的血平板上4~5个菌落，置于无菌生理盐水中，用0.5麦氏比浊管校正菌浓度。 2.接种细菌-涂布法 用无菌棉签浸入细菌悬液中，将拭子在试管上壁轻轻挤压以挤去过多的菌液。棉签在三个方向均匀抹琼脂表面（每次转60℃）使菌液均匀分布，最后沿平板内缘涂抹一周。 3.贴药敏纸片 室温干燥3~5min 各抗菌纸片中心距离应大于24mm，纸片距平板内缘应大于15mm。 4.读取试验结果 经过35℃16～24h孵育，量取抑菌圈直径。 （四）结果判读和报告 1.敏感（S）：表示测试菌可被测定药物常规剂量给药后所达到的血药浓度所抑制或杀死 2.中介（I）：提高药物浓度或药物浓集部位有效。意义不确定 3.耐药（R）：测试菌不能被在体内感染部位可能达到的抗菌药物浓度所抑制，且不管其剂量大小或细菌所在部位 （五）质量控制 1.菌液浓度：0.5麦氏比浊 2.培养基：M-H琼脂，厚度为4mm 3.质控菌株： 金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、肠球菌、流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌等 ATCC:American Type Culture Collection 4.培养要求 大部分需氧菌：（35±2）℃，空气培养，16~18h； 不动杆菌、洋葱伯克霍尔德菌和嗜麦芽窄食单胞菌：（35±2）℃，空气培养，20~24h； 嗜血杆菌属：（35±2）℃，5%CO2，16~18h； 链球菌属和奈瑟菌属的培养时间为20~24h； 淋病奈瑟菌：（36±1）℃（不能超过37℃），5%CO2，20~24h 葡萄球菌检测对甲氧西林、苯唑西林、奈夫西林和万古霉素敏感性时培养时间必须延长至24h（金葡为18h）且温度不超过35℃；检测肠球菌对万古霉素的敏感性时，必须延长培养时间至24h。 三、稀释法 （一）肉汤稀释法 有宏量稀释法和微量稀释法 原理：以M-H液体培养基将抗菌药物做不同 浓度稀释，然后接种待测菌，定量测定抗菌药 物抑制或杀死该菌的最低抑菌浓度（MIC）或最 低杀菌浓度(MBC)。 MIC：抗菌药物能够抑制细菌生长所需要的最低浓度。 单位： μg/ml 或U/ml MBC：抗菌药物能够杀灭99.9%接种菌所需要的最低浓度 例：需配制100 ml浓度为1280μg/ml的抗生素贮存液，所用抗生素为粉剂，其药物的有效力为750μg/mg，需要精确称取抗生素粉剂的量为多少？ 重量=100 ×1280÷750 = 170.7 mg （2）稀释抗菌药物的制备 抗菌药物终含量：128、64、32……0.25μg/ml 原液10倍稀释备用 3.菌液 菌液的准备：0.5麦氏比浊标准（同纸片法） 最终菌液浓度：5× 105CFU/ml 4.实验方法 1）抗菌药物稀释：取试管10支，另取3支标记上“肉汤对照”、“测试菌生长对照”、“质控菌生长对照”。除第1管外每管加肉汤2ml，1、2号管加待测最高浓度药液（128 μg/mg ）2ml，依次对倍稀释至10管。 2）测试菌的准备：0.5麦氏比浊标准，10倍稀释 3）接种细菌：取0.1ml待测菌依次由低浓度到高浓度加到10支管中。