抑肺饮对肺腺癌细胞A549裸鼠移植瘤抑瘤作用.doc

抑肺饮对肺腺癌细胞A549裸鼠移植瘤抑瘤作用摘要 目的：观察中药抑肺饮对肺腺癌细胞A549裸鼠移植瘤的抑制作用，探讨其抑制细胞增殖的作用机制。方法：将肺腺癌细胞A549接种于裸鼠腋窝皮下，形成移植瘤，实验分为阴性对照组、鸦胆子油对照组、抑肺饮高、中、低剂量治疗组，采用流式细胞术检测细胞周期，免疫组织化学法检测P16基因及血管内皮生长因子（VEGF）、P53基因的表达。结果：抑肺饮可明显抑制移植瘤的增长，使G0/G1期细胞明显增多，显著上调P53、P16蛋白的表达，并下调VEGF的表达，与阴性对照组比较，有统计学差异（P0.05)。结论：中药抑肺饮对肺腺癌细胞A549裸鼠移植瘤具有抑制作用，其机制可能与其抑制细胞增殖有关。 关键词 肺癌 抑肺饮 细胞增殖 P53 P16 血管内皮生长因子 裸鼠 肺癌是当今世界上对人类健康与生命危害最大的恶性肿瘤之一。近20年，我国的肺癌发病率以每年11%的速度递增，总患病率已占男性恶性肿瘤首位。因其发病率高，预后较差，86%患者在确诊后5年内死亡，故对其发病机制及防治研究成为当前研究热点问题。从肺癌目前治疗看，单纯西医治疗的临床疗效并不满意。近年来，由于肺癌综合治疗的广泛开展，临床疗效有所提高，特别是中医药在肺癌的综合治疗中发挥了独特的作用。本研究拟观察中药抑肺饮对肺腺癌细胞A549裸鼠移植瘤的抑制作用，并探讨其治疗肺癌的作用机制。 1 材料与方法 1.1 材料:人肺癌A549细胞购自中科院上海生命科学研究院；4~5周龄免疫缺陷BALB/C裸鼠，雌性，体重12~14g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。RPMI-1640培养基购自Gibco公司；中药汤剂抑肺饮为作者经验方；鸦胆子油乳口服液购自延安常泰药业有限责任公司；免疫组化P16、VEGF、P53抗体及免疫组化染色SP试剂盒及浓缩型DAB试剂盒购自DAKO公司； DNA PREPtm Reagents Kit购自BECKMAN-COULTER公司。主要仪器：CO?2培养箱为德国Binder公司产品；裸鼠饲养：浙江省实验动物中心；EPICS-XL型流式细胞仪及 Q-PREP溶血仪为美国BECKMAN-COULTER公司产品。 1.2 方法:方法如下。 1.2.1 裸鼠移植瘤实验：4~5周龄裸鼠60只，将培养好的A549细胞消化收集，用灭菌PBS洗涤细胞两遍；细胞计数，用PBS调节细胞到1×107个/ml，裸鼠皮肤酒精棉球消毒，腋窝皮下注射0.1ml，相当于每只裸鼠接种1×106个细胞。无菌层流环境饲养，细胞接种后10~14天，肿瘤形成。将成瘤的裸鼠随机分为5组，分别为阴性对照组（胃饲生理盐水）、阳性对照组（胃饲鸦胆子油乳口服液）、低剂量组（胃饲低剂量抑肺饮汤剂）、中剂量组（胃饲中剂量抑肺饮汤剂）和高剂量组（胃饲高剂量抑肺饮汤剂），每组12只。给裸鼠称重、编号，每天灌胃1次，每次0.2ml，每隔5天用游标卡尺测量皮下移植瘤的最大长径(a)和横径(b)。根据公式(体积=1/2×ab2)计算，计算各组平均肿瘤体积变化的差值，进行比较，观察生长状态。灌胃27天，将裸鼠处死，称重，移植瘤取下，照相，测量长短经、瘤重；将标本分为两份，一份放生长液，另一份放福尔马林液。抑瘤率公式为：抑瘤率=（C-T）/C×100% 。C为对照组移植瘤平均体积，T为实验组移植瘤平均体积。 1.2.2 流式细胞术方法：①肿瘤组织单核细胞悬液制备：将采集的3.0mm3大小新鲜组织块，置于冷藏的PBS溶液中，反复洗涤去除坏死组织，机械法剪碎组织块，然后在300目铜网搓洗并过滤，最后通过显微镜观察，将悬浮细胞数调至1×106/L。② DNA流式细胞术测定：DNA染色按DNA-Prep Kit 说明书操作后，上FCM检测。取2×106/L样品细胞进行测定，同时以正常淋巴细胞为外参照。通过前向散射光和侧向散射光设门去除细胞碎片，通过荧光信号峰和积分双合线设门去除细胞团块。测定的结果以DNA含量分布直方图显示，通过Multicycle软件对细胞进行DNA增殖周期分析，计算出细胞周期中G0/G1期、S期和G2/M期占整个细胞周期的百分比。 1.2.3 免疫组化方法： 免疫组化采用SP法，参照试剂盒说明书，过程如下：将固定好的移植瘤标本用石蜡包埋，石蜡切片，放置56~58℃烤箱烤片1～2h；常规脱蜡至水，蒸馏水冲洗，PBS冲洗；0.01M枸橼酸抗原修复，取出切片，蒸馏水冲洗，PBS冲洗；3%过氧化氢孵育20min，PBS冲洗；滴加封闭用正常山羊血清，室温孵育20min，倾去，勿洗；滴加1:100比例稀释的一抗， 4℃孵育过夜；取出切片，PBS冲洗； 滴加生物素化二抗工作液，室温孵育15min，而后PBS冲洗；滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，室温