愈创营养油对大鼠皮肤缺损创面愈合过程中VGEFmRNA表达影响.docVIP

愈创营养油对大鼠皮肤缺损创面愈合过程中VGEFmRNA表达影响(1．辽宁中医药大学，辽宁沈阳110032；2．锦州市中心医院，辽宁锦州121000；3．辽宁医学院，辽宁锦州121000) 摘要：目的：从分子水平观察愈创营养油对大鼠缺损创面的修复机理。方法：45只背部造成开放性皮缺损创面的大鼠，随机区组分为空白对照组(A组)外敷生理盐水、VEGF的明胶海绵(B组)外敷组外敷、愈创营养油组(C组)涂抹愈创营养油。观察创面愈合时间、毛细血管截面面数密度(NA)及造模后第3、7、14天用RT-PCR的方法检测VEGFmRNA。结果：愈创营养油组愈合时间最短，优于其他各组，与模型组相比有非常显著性差异(P＜0.01)，且愈创营养油组7天毛细血管截面面数密度对照组相比有非常显著性差异(P＜0.01)，在3天和7天VEGFmRNA的表达各组闻均有显著性差异，以愈创营养油组表达最好，而14天各纽间则没有差异。结论：C组最好，它的作用机制可能是愈创营养油应用后产生的VEGF能明显促进上皮生长、创面愈合。 关键词：愈创营养油；大鼠；VGEFmRNA；愈合；实验研究 中图分类号：R-33　文献标识码：A 文章编号：1673-7717(2007)05-1007-03 愈创营养油经本院多年的临床验证，有明显的促进皮肤缺损创面愈合的作用。为进一步研究该油促进皮肤缺损创面愈合的的机理，笔者进行了动物实验观察，观察愈促营养油对大鼠皮肤缺损创面的修复中VGEFmRNA的表达情况，为临床应用提供实验依据。 1材料与方法 1.1药物及制剂 愈创营养油主要成分：蛋黄油、牛油、羊油、猪油、麻油等组成。对照组药物：VEGF(血管内皮生长因子)购自美国RD Systems公司，体外培养的内皮细胞检测其生物学活性，有效浓度为1.0～10ng/μL。在垂直层流净化工作台上用无菌注射用水将VEGF配成10ng/100μL的工作液。VEGF CD31、CDK4免疫组化试剂盒：购自武汉博士德生物工程公司。 1.2实验动物与造模方法 普通级大鼠45只(锦州医学院实验动物中心提供)，体重200～250g，雌雄不限。常规饲养3天后，用硫化钠脱去背部区域的毛。3天后，大鼠于腹腔内注射3％戊巴比妥钠0.15mL/100g麻醉，麻醉成功后，用外科方法剪去两块直径3.0cm的圆形全层皮肤切除开放创面，深达筋膜。止血，待情醒后单笼饲养。 1.3实验分组与给药方法 随机分为3组，空白对照组(A组)15只、外敷VEGF组(B组)15只，愈创营养油组(C组)15只。混合饲料单笼饲养，自然光照射，室温控制在25℃左右。创伤模型制成后，即刻在A组大鼠的创面上，生理盐水纱条并用无菌敷料包扎创面；B组大鼠的创面上敷含有40ng VEGF的明胶海绵，再用无菌敷料包扎创面；C组大鼠在创面上用愈创营养油涂抹1mm厚然后再予无菌敷料包扎创面。每组均为隔日换药1次剂量同前，直至愈合。 1.4观察项目与检测方法 1.4.1创面愈合时间　记录各组造模后至创面愈合所需时间。 1.4.2截面面数密度(NA) 即单位肉芽组织切片面积内的毛细血管截面数。上面方法于伤后第3、7、14天用方格系统(D=0.25μm)随意选定5个视野计算出每平方微米毛细血管截面数量NA=N/A；其中N为落在测试框中的毛细血管截面总和，A为5个视野的总面积，A=D2×P(点数)。 1.4.3 RT-PCR的方法检测VEGFmRNA　分别于术后 3.7.14天，切取3组大鼠相同的有活力的皮瓣组织，取材后快速放入液氮中冷冻。组织彻底冻透后放人-90℃冰箱里保存。 总RNA提取：取冻存的组织约100mg，于研钵内充分研磨成粉末，将其放人EP管中加RNA提取试剂TRIzol1mL后继续研磨研至匀浆，静置10min，低温离心机12000r/min离心5min，小心吸取上层液体加入氯仿0.2mL，震荡器震荡30s，再低温离心5min，小心吸取上层液体，加等体积异丙醇，震荡30s，充分混合，低温离心10min，吸弃上清，加入75％酒精750μL，振荡器震荡混匀30s，12000r/min离心2min，吸弃上清，通风橱干燥20 min，加入DEPC水40μL溶解RNA沉淀，存放-70℃，备用。琼脂糖凝胶电泳判断RNA质量。 逆转录反应：按逆转录试剂盒说明操作，取总RNA3μL、10倍逆转录反应缓冲液4μL、4种单核苷酸各20mmol、随机引物15μg、RNA酶抑制剂50U、AMV逆转录酶20U，加DEPC处理水使反应体积达20μL，30℃10min，42℃孵育1h，70℃10min使酶失活，得到cDNA产物。 PCR扩增：反应体系中包含10倍PCR反应缓冲液2