中药联合干细胞蛛网膜下腔移植对缺血再灌注大鼠脑脊液NGF影响.docVIP

中药联合干细胞蛛网膜下腔移植对缺血再灌注大鼠脑脊液NGF影响（1.辽宁省血栓病中西医结合医疗中心中药药理实验室，辽宁 沈阳 110101；2.沈阳血栓病研究所,辽宁 沈阳 110101） 摘 要：目的：研究中药对蛛网膜下腔移植骨髓单个核细胞（BMNC）或骨髓间充质干细胞（BMSC）治疗缺血性脑卒中大鼠干细胞因子的影响。方法：分离培养BMNCs和BMSCs,140只Wistar大鼠随机分为7组：1正常组，2假手术组，3模型组，4BMNC组，5BMNC联合中药组，6BMSC组，7BMSC联合中药组。3、4、5、6、7组应用线栓法建立大鼠大脑中动脉缺血再灌2h模型（MCAO），24h后通过蛛网膜下腔注射法移植100微升0.01MPBS溶液（3组）、BMNCS悬液（4组、5组，2.0×107个）或BMSCs悬液（6组、7组，2.0×107个），5组、7组当日进行中药灌胃。应用定量ELISA法于移植后4天、28天检测脑脊液（CSF）内Neural growth factor（NGF）含量。结果：模型组CSF中NGF水平在移植后28天有所升高，4、5、6、7组在移植后4dNGF水平均较模型组明显升高（P Key words:Neural growth factor（NGF）; bone marrow mesenchymal stem cells（BMSCs）;Bone marrow mononuclear cells（BMNCs）;stem cell transplantation; subarachnoid; traditional Chinese medicine（TCM）; middle cerebral arterial occlusion （MCAO）; cerebrospinal fluid （CSF） 骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSC）和骨髓单个核细胞（bone marrow mononuclear cells，BMNC）通过多向组织分化、分泌多种神经营养因子（NTF）和调节免疫等机制［1-3］，促进损伤、衰老器官的结构及功能修复，成为治疗组织损伤性疾病理想的种子细胞，对脑梗塞的治疗具有重要意义。我们应用中药复方联合BMSC或BMNC蛛网膜下腔移植的方法治疗缺血再灌注脑损伤大鼠,应用定量ELISA方法，检测和比较大鼠脑脊液和脑组织内Neural growth factor（NGF）浓度变化，分析BMSC和BMNC经蛛网膜下腔移植，以及中药联合两种细胞移植治疗缺血性脑血管病的生物学机制。 1 实 验 1.1 材料 实验动物：SPF/VAF级健康雄性wistar大鼠150只（北京维通利华实验动物技术有限公司）。其中，3～4月龄，（280±20）g，140只；3～4周龄，（80±10）g，10只。主要试剂：培养基L-DMEM（美国GIBCO公司）;胎牛血清（美国GIBCO公司）;0.25%胰酶（美国GIBCO公司）; 大鼠淋巴细胞分离液（天津血液研究所）；蝮龙抗栓丸（辽宁省血栓病中西医结合医疗中心），主要成分为天麻、菖蒲、黄芪、丹参、川芎、蝮蛇等。主要设备：550微孔板酶标仪（美国Bio-rad公司），MK2型洗板机（芬兰雷勃公司），移液器（德国Eppendorf公司）,倒置显微镜（日本Olympus公司），303-3CO2培养箱（上海阳光实验仪器有限公司,DY89-11电动匀浆机（宁波新芝生物科技股份有限公司）。 1.2 方法 1.2.1 动物分组与干预 3～4月龄雄性Wistar大鼠140只,采用PEMS 3.1数据分析软件随机数字法分为7组：1正常组、2假手术组、3模空组、4BMNC组、5中药联合BMNC组、6BMSC组、7中药联合BMSC组，每组20只。因手术意外等原因，最终纳入112只，平均每组16只。 1正常组大鼠不做处理；2假手术组大鼠操作至暴露颈内动脉、颈外动脉；3模型组、4BMNC组、5中药联合BMNC组、6BMSC组、7中药联合BMSC组建立大鼠大脑中动脉栓塞2h再灌注模型。造模成功者术后24h，进行蛛网膜下腔移植手术：1组不进行移植，2假手术组、3模型组枕骨大孔注射100μL 0.1MPBS溶液，4BMNC组、5中药联合BMNC组枕骨大孔注射100μL BMNCs细胞悬液（2×107个）,6BMSC组、7中药联合BMSC组枕骨大孔注射100μL BMSCs细胞悬液（2×107个）。5中药联合BMNC组和7中药联合BMSC组移植当天进行中药蝮龙抗栓丸溶液灌胃，剂量为成人公斤体重的3.15倍，日1次。移植术后4天、28天分组活体取大鼠脑脊液。 1.2.2 动物模型制备 Zea