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VEGF基因治疗及血管化作用探究进展血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是目前最强有力的血管生成因子[1],能增加微静脉、小静脉的通透性,促进血管内皮细胞分裂与增殖,使细胞质钙聚集,诱导血管生成,在胚胎发育、创伤愈合、肿瘤生长与转移过程中起重要作用,因此VEGF的血管化作用是机体生理及病理性组织生长和损伤愈合的基础。本文就VEGF基因治疗在血管化方面的作用进展作一综述,为进一步研究VEGF基因治疗与血管化作用提供理论基础。 1VEGF及其受体 1989年,Connolly等[2]从正常垂体滤泡细胞中分离出了一种能选择性促进血管内皮细胞形成的蛋白质,称之为血管内皮细胞生长因子(VEGF)。VEGF是一个分子量为45000,能与肝素结合的二聚体糖基化的碱性蛋白,它在多种细胞与血管生成相关的进程中表达。人的VEGF基因位于染色体的6p21,由8个外显子及7个内含子构成,基因全长28kb,编码基因长14kb,分子量约34～45kD[3],编码产物为同源二聚体糖蛋白,等电点为8.5,有很强的耐热和耐酸能力。目前已发现的VEGF家族包括七个成员即VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF-F和PIGF(Placeta Growth Factor,胎盘生长因子)[4]。VEGF-A发现最早,故多数文献中的VEGF即指VEGF-A,在组织和细胞中含量最丰富,功能最强,是以二硫键相连的寡二聚体糖蛋白,分子量为35～45KD,经过不同的剪切方式可以7种不同的亚型出现,分别是VEGFl21、VEGF145、VEGF148、VEGF165、VEGF183、VEGF189及VEGF206,VEGF165为最主要的同分异构体[5]。 血管内皮细胞生长因子受体(Vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)是VEGF特异性的膜受体,具有高亲和力,属于酪氨酸激酶亚家族中的一个新成员。作为一种典型跨膜镶嵌蛋白,分为胞外区、跨膜区及膜内区三部分,以胞外7个免疫球蛋白样的超二级结构、胞内两个间开的酪氨酸激酶区为其特征。目前已知VEGF家族有三个受体:VEGFR-l、VEGFR-2、VEGFR-3,分别由fit-1、flk-1-KDR、fit-4基因编码[6],其中VEGFR-2即KDR主要参与血管形成过程[7]。 2VEGF促血管化作用 VEGF最主要的生物学作用是通过和血管内皮细胞的特异性受体结合,从而促进动脉、静脉以及淋巴管来源的内皮细胞生长[8],其他血管生成因子的作用大多是通过增强VEGF的表达而间接实现。自身内源性的VEGF是机体组织损伤恢复重要的血管生长因子,Akira[9]通过实验证实肌肉损伤后的早期VEGF及其受体的mRNA表达明显增高,与损伤早期的血管化程度密切相关,从而也间接说明了VEGF的重要血管化作用。治疗性血管生长是针对治疗缺血性血管疾病的一个新概念,它包括诱导血管发生、小动脉生成及淋巴管生成[10]。在血管生长中,VEGF调节内皮细胞外基质溶解、内皮细胞迁移、增生和管腔形成。VEGF在多种在体模型中强烈地促血管生成作用已经被多个实验证实[11]。 3VEGF基因治疗途径的发展 VEGF的半衰期很短,仅为数小时甚至更短,Shima等[12]认为VEGF165的生物半衰期在正常氧分压下是30～45min,在低氧下是6～8h。由于VEGF生物半衰期短,注入体内易稀释,故外源给予VEGF蛋白质进行治疗效力有限,为克服单纯蛋白质治疗的缺点,人们考虑应用VEGF基因治疗,即将外源VEGF基因导入目的细胞并有效表达,从而达到治疗目的。近20年来,VEGF基因治疗方法得到了不断发展。基因治疗需要合适的载体,目前被研究应用最多的是腺病毒载体,有实验证实重组腺病毒Ad.VEGF165滴度高、毒性低、转染效率高、体外转染安全[13]。实践中遇到的问题是导入的基因难以在体内持续表达,有些难以获得有效基因转移,体外细胞增殖困难,自体细胞来源少及再移植后存活率低等。于是,Sun[14]和Chang等[15]提出了异体细胞基因治疗的策略,即将目的基因导入已建立的细胞系内,使其表达基因产物,再将其移入患者体内。这种方法虽然扩展了细胞来源,但是免疫排斥反应又限制了其应用,同时为了增加重组基因工程细胞数量,多采用具有高分裂活性的细胞株,易形成肿瘤。随着微囊化技术的出现,人们尝试应用该技术,将重组基因细胞用微囊包裹后进行移植,以此外源基因为模板,转基因细胞为加工厂,在体内编码生产治疗性蛋白[16-17]。微囊化技术既克服了免疫排斥反应,又限制了邻近细胞过度增殖,使同种异体移植