实验与数据分析方法.docVIP

Agilent 实验原理及步骤 一、总RNA抽提（TRIzol法） 每2×107细胞加入1 ml Trizol，在旋涡震荡器上混匀；对于组织样品，每100mg组织可以加入1 ml Trizol，用液氮研磨或采用电动匀浆器充分打碎组织块。 加入约1/5体积的氯仿，上下颠倒充分混匀1 分钟左右，室温下静置5 分钟。 4℃，12,000 rpm 离心15 分钟后小心取出上清液，将上清夜转入新的1.5 ml离心管，加入等体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀，室温静置5 分钟。（15ml离心管用7,500rpm离心20min） 4℃，12000 rpm离心10 分钟后，去上清，向沉淀中加入2/5体积的70% 乙醇， 4℃，12000 rpm离心洗涤沉淀15 分钟。（15ml离心管用7,500rpm离心20min） 去上清，沉淀室温晾干后加入适量无RNA酶的水充分溶解沉淀，测定OD260 和OD280值。 (optional)对于从组织样本抽提的总 RNA，为了更好的去除基因组DNA 的污染，可以采用无RNA 酶的DNA酶I 处理，从而提高样品纯度。 二、总RNA质量检测（Lab on chip检测） （一）琼脂糖胶电泳 1、配置用DEPC处理的电泳缓冲液50?TAE，高压灭菌后待用。 2、使用电泳槽前用3?H2O2浸泡15min，然后用DEPC处理的水冲洗，倒入适量1?TAE电泳缓冲液。 3、称取适量琼脂糖，加入1?TAE电泳缓冲液，制备1?的胶（注意使用专用的溶液和相关设备，避免引入外源RNA酶）。 4、用专用6?Loading buffer做指示剂，取10μl上样电泳（电压100伏）15min。 5、关闭电源，取出电泳胶，在凝胶成像仪上观测、拍照，保存图像。 6、评价总 RNA或 mRNA质量（见FAQ）。 通过目测28S和18S的亮度比例可以初步评价总RNA的质量。一般认为28S:18S?2可以初步判定总RNA质量较好，如图1所示。 图1 1?agrose胶电泳人胎盘总RNA ?28S ?18S （二）Lab-on-chip 1、胶制备 取出400μl RNA gel Matrix，加入Spinfiter柱子，离心过滤凝胶（1500?g， 10min）。 2、取出130μl过滤胶到1.5mlEppendorf管中，再加入2μlRNA Dye Concentrate，在vortexer上振荡混匀。 3、用RNA ZAP清洁操作区，同时在Electrode cleaner中加入350μlZAP，放入Lab on chip正确位置，合盖清洁探头1min。 4、再用另外一Electrode cleaner中加入350μlDEPC 处理的H2O,重复步骤3。 5、移开Electrode cleaner,让探头自然干燥。 6、取出一新的RNA Chip，吸取9μl步骤2制备的凝胶加入G 孔中。 7、将chip放置于带有活塞（plunger）的水平台上（chip priming station），将plunger拉杆向上拉倒1ml刻度出，再将chip priming station的盖子合上，压紧chip。同时向下推动拉杆至底部并维持30秒左右，松开让拉杆自动弹开。 8、从chip priming station上取出chip，用放大镜检查是否有气泡存在，如果在微通道中有气泡，需要重复步骤7。再在标有G的两个孔中各加入9μl步骤2制备的凝胶，在标有 的孔中加入5μLrna 6000 Nano Marker。同时在12个加sample的孔中滴加5μl RNA 6000 Nano Marker（不能空一个孔）。 9、取1μl RNA 6000 ladder 滴加到标有 的孔中，再各取1μl样品（RNA）加入12个样品孔中，并将chip放入IKA Vortexer上，在set-point振幅处振动1min（注意：必须卡紧chip，否则在振动过程中会跳出来）。 10、振荡好后的chip在5min之内必须放入Agilent 2100分析仪上，按照软件提示进行RNA电泳操作。 11、评价RNA质量。见（FAQ） 如图3所示，为经过Agilent 2100分析得到的完整的人胎盘总RNA。 具体操作步骤参考人cDNA表达谱芯片使用手册,SBC-H-HC-100-22，具体结果见《样品质检报告》。Lab-on-chip 参照Agilent 2100分析仪操作手册，制备凝胶，按照软件提示进行RNA电泳操作，评价RNA质量。 三、总RNA的纯化（QIAGEN RNeasy? Mini Kit） 如果总RNA的纯度不高，会影响探针的标记效率和芯片杂交结果。所以使用QIAGEN RNeasy? Kit纯化总RNA，详细操作原理和方法见RNeasy