酸性区3融合重链促进基于蛋白质内含子的双载体B域缺失型凝血因子.PDF

生物化学与生物物理进展 Progress in Biochemistry and Biop hys ics 2010, 37(11): 1225~ 1231 性区 融合重链促进基于蛋白质内含子的 3 双载体 域缺失型凝血因子 转基因表达* B ** 朱甫祥 杨树德 刘泽隆 缪 静 屈慧鸽 迟晓艳 (鲁东大学生命科学学院，烟台264025) 摘要 最近的研究表明，蛋白质内含子(intein)介导的B 区缺失型凝血因子 (BDD-F ) 的轻链和重链剪接可顺式促进后者的 分泌，而且剪接反应在细胞内、外均可发生 为进一步提高基于蛋白质内含子的双载体转 - 基因的功效，将具有促进 BDD F 重链分泌作用的位于Pro1640～Ser1690 的酸性区3(acidic region-3，AR-3)引入重链，检验对蛋白质内含子剪接的BDD-F 蛋白分 泌和活性的影响 用融合蛋白内含子的附加 - 重链( ) 基因和轻链( )基因共转染培养的HEK293 细胞，分 ar 3 H CA R3IntN IntCLC 用ELISA 和Coatest 法定量分析分泌至培养上清中剪接BDD-F 蛋白量和生物活性，并用免疫印迹观察了细胞内的 BDD-F 剪接 结果显示，共转H CA R 3IntN 和IntCLC 基因细胞，分泌至上清的剪接BDD-F 蛋白量和活性分 为 (173 26) g/L 和(1.31 0.15) U/ml ，明显高于未添加 - 的蛋白质内含子融合重链( )与轻链( )基因共转染细胞 依 滋 依 ar 3 H CIntN IntCLC [(102 12) g/L和(0.79 0.09) U/ml]，提示AR-3 对蛋白质内含子剪接的BDD-F 蛋白分泌和活性有明显改善作用 而且，分 依 滋 依 转 和 基因细胞混合培养后的上清中，亦检测到剪接的 BDD-F 蛋白和活性[(35 7) g/L 和 H CA R 3IntN IntCLC 依 滋 (0.28依0.08) U/ml]，表明蛋白质内含子可进行不依赖细胞机制的蛋白质剪接 另外，转基因细胞总蛋白呈现明显的可与F 多 克隆抗体进行反应的剪接BDD-F 蛋白条带，直观地反映细胞内BDD-F 的剪接 为动物模体内运用蛋白质反式剪接技术 的双腺相关病毒载体(AAV)转 - 基因实验提供了依据 BDD F 关键词 凝血因子 ，酸性区3，分泌，蛋白质内含子，蛋白质反式剪接 学科分类号 Q7 DOI: 10.3724/SP.J.1206.2010.00235 凝血因子 (F )虽然与因子 (F )具有相 的轻链多肽归于 “无效分泌” 如何提高基因共转 吁 吁 的结构域组成A 1-A2-B-A3-C1-C2，而且二者的A 染率和重链分泌效率是改善双载体转 基因的关