蛋白质组学tap技术在生命科学中的重要意义.docVIP

TAP技术在生命科学中的重要意义 陈戬 第三军医大学全军免疫学研究所 重庆 400038 摘要：TAP（串联亲和纯化）技术是一种在生理条件下采用两步亲和纯化来分离蛋白质复合物的技术，尽管这种技术在酵母细胞体系中已经得到了广泛的应用，但在哺乳细胞体系中这种技术的应用却十分的局限，本文主要就TAP技术的原理、TAP标签的种类、TAP技术在哺乳动物细胞体系中的运用以及目前取得的重要进展四个方面进行阐述，揭示了TAP技术在分离、鉴定蛋白复合体过程中的重要应用。 关键词：TAP技术 哺乳细胞 蛋白质相互作用 标签 众所周知，细胞的功能是通过大量不同的蛋白质相互协调作用而体现出来的，随着时间和空间的不同，蛋白与蛋白之间也存在着不同的交互作用以满足细胞的需求，因此分析研究蛋白质复合物的构成及其之间的相互作用对于从以往基因型的研究过渡到显型的研究十分重要，因此TAP技术应运而生，TAP技术最早运用于生理条件下酵母细胞中蛋白质复合物的纯化，而后由于在高等生物中难以进行原位蛋白的标记以及存在内源蛋白的干扰，TAP技术的发展曾一时受到一定程度的限制。随着TAP技术的不断更新和TAP标签的日益发展， TAP技术已日趋成熟并很容易标准化，为以后研究无论是在原核生物或真核生物蛋白质相互作用中提供了有力的支撑和平台。 TAP技术的原理 TAP技术包括向把蛋白融合TAP标签以及将其转染至宿主细胞，通过基因工程给被分离纯化蛋白的一端加一个TAP标签，IgG结合结构域（ProtA）及一个钙调蛋白结合多(CBP)组成，TEV蛋白酶切位点隔开。通过基因重组将细胞内源性的目标蛋白基因置换为带有TAP标签的基因，，，IgG亲和柱，TAPProtA端会与IgG形成强结合，，TEV蛋白酶的洗脱夜将蛋白质复合体切割下来。在钙离子参与下，CBP的蛋白质复合体与钙调蛋白紧密结合，，， 可以说，与传统的研究蛋白质相互作用的技术相比，TAP，，TAP技术还特别适用于蛋白质组水平上的大规模研究。 TAP标签的结构、种类及应用 我们知道，每一种蛋白都有其特殊的生化和物理特性，FLAG标签、金黄色葡萄球菌蛋白A(ProtA)的2个IgG结合单位、Strep标签、His标签、钙调蛋白结合肽(calmodulin-binding peptide，CBP)(chitin-binding domain，CBD)ProtA和CBP标签能以融合蛋白的形式，低浓度存在于复合体中的情况下获得有效的回收。但实际上，，Martinez等在研究STAGA复合体时使用的是FLAG-HA串联标[1]Knuesel等[2]则构建了用于哺乳动物的反转录病毒TAP载体，CBP会与细胞中的很多内源蛋白结合，FLAG替代了CBP，ProtA-FLAG串联标签。不过，FLAG标签不仅会把大量Flag抗体带入回收产物中，，，2种，Honey[3]构建了一种多亲和纯化(multiple affinity purification，MAFT)CBP-His6-HA3 (CHH)，cyclin2CDK复合体相关的蛋白。这说明在TAP技术中标签的选择并非如此局限，ProtA-CBP串联标签。尽管如此，国外有报道称链球菌蛋白G的2个IgG结合单位和链霉抗生物素蛋白结合肽（streptavidin-binding peptide，SBP）组成的GS-TAP串联标签较之ProtA-CBP串联标签在初始物的用量、细胞材料的获取上以及在TEV蛋白酶切割后对诱饵回收再利用方面有着明显的优越性，使得分离的流程变得更加简单和经济。 三、TAP技术在哺乳细胞体系中的应用及意义 虽然TAP技术已经能对酵母、大肠杆菌、植物、果蝇等生物体系中蛋白质的相互作用进行大规模的研究，但在哺乳动物细胞体系中却一直受到很大的限制，因为在不同的生物体系中，串联亲和纯化技术的区别主要在于融合蛋白的表达，由于在哺乳动物中难以进行原位蛋白的标记以及存在内源蛋白的干扰再加上哺乳动物细胞同源重组效率较低，所以在一定程度上TAP技术在哺乳动物细胞体系中的运用较为局限，目前人们常常将融合基因构建到载体上，用转染的手段将其导入到动物细胞系中。但是转染的直接影响就是融合蛋白的异常高表达，这往往引起细胞生理活动的异变，过量的蛋白质也会引起不正常的折叠，细胞定位的变化和细胞应激反应等大量的假阳性相互作用的产生，需要更多的验证[4]。Forler等[5]在果蝇细胞体系中率先尝试RNA干扰（RNAi）与TAP技术相结合，建立了iTAP技术，运用这种技术在很大程度上解决了这个问题，RNA干扰是指一些段片段的双链RNA引发转录后基因静默的机制，通过特异的阻断体内特定基因表达，诱使细胞表现出特定基因的缺失表型。实验时只需用TAP技术对目的蛋白参与形成的复合物进行纯化数天，将其反义RNA分子