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蛋白质低温电镜结构分析简介 张德添 生物电子显微学是通过电子显微镜技术和电镜图像处理技术，能够直观地提供生物大分子的形貌和结构信息。电子显微学技术方法主要由三个部分组成。它们是电子晶体学技术，单颗粒技术和电子断层成像技术。由于这些技术的结构解析对象的尺度 范围，介于X- 射线晶体学与光学显微镜之间。因此，特别适合于从蛋白质分子结构到细胞和组织结构的解析分析研究工作中。 以低温电镜技术与三维重构技术为基础的低温电子显微学技术方法，近年来在国 际上得到发展迅速和应用。已经成为继X- 射线晶体学技术和核磁共振波谱学技术后，分析和研究生物大分子结构的三大主要手段之一[1]。 一、结构生物学技术 随着人类基因组计划的完成，生物学进入了后基因组时代。但是生物大分子与这些基因的种种联系，包括如何转录、翻译、加工、组装等，都不十分清楚。生物大分子在细胞和细胞器中，如何排列和相互作用，也都不十分清楚。 众所周知，生物界中的结构生物学有着不同的层次结构。从个体、器官、组织、细胞、到生物大分子。虽然生物大分子处于生物界的最低位置。但却决定着生物界高层次系统之间的差异。为什么要研究生物大分子的结构呢？因为结构(主要指三维结构)不仅决定功能，而且结构是研究应用的基础。其中包括例如，药物设计，基因改造，疫苗研制开发，人工构建蛋白等。曾经有人预言，结构生物学研究的任何突破，将会给生物学界研究带来一场新的革命。 目前，国际上研究大分子结构的主要方法和手段有：X-射线晶体学，核磁共振波 谱学和生物电子显微学。三种测定方法和手段各有优缺点。而生物电子显微学适用于从分子到细胞各个结构层次的三维结构研究。生物电子显微学是研究结构生物学的重要一环。应该说生物电子显微学与 X-射线晶体学和核磁共振谱学一道，都是结构生物学的重要研究手段和工具。在以上问题的研究中，能够起到重要的作用和担当重要的角色[2]。 二、生物电子显微学技术 电子显微镜在生物医学中的应用经历的几个主要阶段：上个世纪30-50年代，初级阶段；上个世纪50-60年代，第一次高速发展阶段。电子显微镜成为研究细胞生物学的最重要的不可缺少的工具和手段。 上个世纪70-80年代，相对比较低潮阶段；上个世纪90年代以后,电子显微镜在生物医学中的应用又引来了第二次高速发展阶段。电子显微镜成为研究分子向细胞过度的主要手段和工具。 电子显微学分辨率的发展概况：上个世纪50年代，发明了负染技术。分辨率达到2nm。上个世纪60年代, 提出了电子显微图像的三维（3D）重组理论。上个世纪70年代，建立了电子晶体学。分辨率达到 0.7nm。上个世纪80年代，发明了快速冷冻技术，从此诞生了低温电子显微镜术。分辨率达到0.3nm。 电子显微镜技术在生命科学中的应用领域非常的广泛。涉及的研究学科有：超微结构学、病毒学、冷冻电子显微学、原子力显微学、细胞生物学、显微镜技术学、扫描电子显微学、分子显微学等。电镜在细胞生物学中研究对象，涉及较多的有：核基质和核结构、内质网结构与功能、不对称单位膜、细胞内吞和自体吞噬、细胞凋亡等内容。 电子显微镜的主要优点。分辨率高：透射电镜(TEM)和扫描电镜(SEM)的分辨率分别达到0.07nm和0.4nm。放大倍数范围宽:透射电镜(TEM)和扫描电镜(SEM)的放大倍数范围都能达到几十倍至几十万倍,甚至一百多万倍以上。各类附件配件软件齐全,能容易地满足不同工作需要。如生物冷冻电子显微学及图像三维重组技术。因此，在细胞和亚细胞水平研究生物样品的超微细结构，离不开电子显微镜，特别是透射电子显微镜。各种细胞器、病毒、细胞表面精细结构的观察与分析都必须主要依靠 TEM和 SEM电子显微镜。例如，2003年爆发的SARS期间，主要元凶冠状病毒，就是利用TEM透射电镜所拍摄和检测出来。见下图示： 我们电镜室在 SARS患者尸检肺组织分离培养病毒阳性的细胞中，在飞利浦CM120 型透射电镜上，成功地观察和拍摄到冠状病毒。还首次检查出：样品中有呼肠病毒的感染；同一个样品中，不同细胞分别感染了冠状病毒和呼肠病毒； 同一个细胞内，同时感染了冠状病毒和呼肠病毒等情况[3]。 电子显微镜的主要缺点。生物样品制备比较复杂，周期相对长一点。特别是TEM。生物样品的观察区域有一定的局限性。TEM主要看超薄切片的二维结构；SEM主要看样品的表面形貌。仪器设备一般都比较庞大和昂贵。如生物冷冻电子显微学及图像三维重组技术,还有一定的难度和局限性。 生物电子显微学须解决的问题，主要包括电子显微镜本身和生物样品的制备技术两个方面。 电子显微镜本身要提高图像衬度；提高分辨率和信噪比等；推广和利用电镜的三维重组技术等。例如，利用场发射电子枪，保证场发射电子的相干性好，保证信号失真度小。利用球差校正器和能量过滤器技术，可以去除非弹