超氧化物歧化酶(sod)过氧化物酶(cat)苯丙氨酸解氨酶(pal)实验测定方法总结.docVIP

超氧化物歧化酶（SOD）活性测定-----氮蓝四唑（NBT）法 依据测定的蛋白含量计算出不同品种葡萄所需的酶液量（mL），并按照表2顺序加入试剂，注意核黄素要最后加入，共做6管。 表2 NBT法测定SOD酶活性 50mM pH 7.8磷酸缓冲液（mL） 130mM 甲硫氨酸溶液（mL） 750μM 氮蓝四唑溶液（mL） 100μM EDTA-Na2 （mL） 蒸馏水（mL） 酶粗提液（mL） 20μM 核黄素溶液 （mL） 1 3.2 0.6 0.6 0.6 0.4 0 0.6 2 3.2 0.6 0.6 0.6 0.4 0 0.6 3 3.18 0.6 0.6 0.6 0.4 0.02 0.6 4 3.18 0.6 0.6 0.6 0.4 0.02 0.6 5 3.18 0.6 0.6 0.6 0.4 0.02 0.6 6 3.18 0.6 0.6 0.6 0.4 0.02 0.6 注：1号为不光照对照管，2号为光照对照管 各溶液显色反应用量混合后，将1号管置于黑暗处，其余各管置于光照处，反应约10 min（温度低时，反应时间延长；光照强时，缩短反应时间）。反应结束后，全部移入暗处，以不光照对照管作为空白对照，在560nm处测定吸光度，记录数据。 以每变化0.1个吸光度为一个酶活单位 SOD酶活计算公式：SOD（U/Pr.mg)=(Ack-Ae)/(Ack*0.1*C) 式中：C-蛋白含量（mg） Ack-用缓冲液代替酶液的照光对照管吸光度 Ae-样品管吸光度 试剂配制方法： （1）0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）。91.5ml0.05MNa2HPO4（1.638582g）0) （2）130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml。 （3）750μmol/L氮蓝四唑溶液：称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。 （4）100μmol/L EDTA-Na2溶液：称取0.03721g EDTA-Na2，用磷酸缓冲液定容至1000ml。 （5）20 μmol/L核黄素溶液：称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml，避光保存。 过氧化物酶（CAT）活性测定----紫外吸收法 取6只试管，其中两个为对照管，依据测定的蛋白含量计算出不同品种葡萄所需的酶液量（mL），并按照表3加入试剂。 表3紫外分光发测定CAT酶活性 0.2M pH7.8磷酸缓冲液（mL） 蒸馏水 （mL） 酶粗提液 （mL） 1（对照） 1.7 1 0 2 1.5 1 0.2 3 1.5 1 0.2 4 1.5 1 0.2 5 1.5 1 0.2 25℃预热后，逐管加入0.6mL 0.1M的H2O2 。每加完一管立即计时，并迅速倒入石英比色皿中，在260nm下测定吸光度，每隔2 min读数一次，共测12min,待4个管全部测完。记录数据，计算活性。以1min内A240减少0.01的酶量为1个酶活单位（u） CAT活性计算公式(U/g.Pr/min)= △A240/(C*0.01*t) 式中：△A240 = A240(ti)—A240(tt) C—蛋白含量 0.01—A240每下降0.01为1个酶活单位（u）； t—加过氧化氢到最后一次读数间的时间（min）。 试剂配制方法： （1）0.2M pH7.8磷酸缓冲液：0.2mol/L Na2HPO4 91.5ml(6.553962g)+0.2mol/L NaH2PO4 8.5ml(0.265217g) (2) 0.1M H2O2 ：（30%的H2O2 溶液5.68mL稀释至1000Ml）Acr-Bis （mL） TEMED（uL） 10%APS （uL） 取量 3.45 2.5 4.0 20 70 等分离胶完全凝固后，吸出蒸馏水，把按照表5配制好的浓缩胶倒入两板之间，直至凹板约0.5cm处停止，插入梳子，待凝固。 表5浓缩胶 4% 蒸馏水（mL） 浓缩胶缓冲液（mL） 30%Acr-Bis （mL） TEMED（uL） 10% APS （uL） 取量 6.2 2.5 1.33 20 70 等浓缩胶完全凝固后，缓慢拔出梳子，把电泳装置放入电泳槽，加入5×电极缓冲液，使液面高出凹板少许。按照测定的蛋白含量确定各个葡萄样本的点样量。点完样，通电电泳。在浓缩胶中以20 mA的电流进行电泳，等进入分离胶后，调节电流至45 mA，直至颜色样量距离胶板边缘1cm处停止。取下胶板，放入培养皿中，倒入一定量的显色液，在4℃、黑暗条件下放置30 min，并不断摇匀，之后在4℃、光照条件下，摇动，直至蛋白条带显出。 试剂配制方