细胞丙酮酸激酶总活性比色法定量检测试剂盒产品说明书（中.PDFVIP

细胞丙酮酸激酶总活性比色法定量检测试剂盒产品说明书（中文版） 主要用途 细胞丙酮酸激酶总活性比色法定量检测试剂是一种旨在通过丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶的酶偶联 反应系统中还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH ）氧化后峰值的降低，即采用比色法来测定细胞裂解萃 取样品中酶活性的权威而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。其适用于 各种细胞裂解萃取悬液样品（动物、人体、植物、昆虫等）丙酮酸激酶的总活性检测。产品严格无菌，即 到即用，操作简捷，性能稳定。 技术背景 丙酮酸激酶（Pyruvate Kinase ；PK ）是细胞代谢的调节酶，催化细胞糖酵解的最后反应：将磷酸烯醇丙酮 酸（phosphoenol pyruvate ；PEP ）转化成丙酮酸（pyruvate ），同时产生ATP 。丙酮酸激酶由4个相同的亚单 位构成，在肝组织、肌肉组织和红细胞中有不同类型的异构体。果糖-2，6-二磷酸（Fructose-2 ，6-bisphosphate； F2 ，6BP ）是该酶的激活剂，而ATP 、蛋氨酸（alanine ）、乙酰辅酶A （Acetyl-CoA ）是该酶的抑制剂。丙 酮酸激酶的活性检测用来评价细胞或组织，包括红细胞的损害状况。基于磷酸烯醇丙酮酸转化成丙酮酸后， 通过乳酸脱氢酶系统，测定还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide ；NADH ） 转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide ；NAD ）的峰值变化（340nm 波长）， 来定量分析丙酮酸激酶的活性。丙酮酸激酶反应系统为： 产品内容 清理液（Reagent A ） 毫升 裂解液（Reagent B ） 毫升 缓冲液（Reagent C ） 毫升 反应液（Reagent D ） 毫升 底物液（Reagent E ） 毫升 阴性液（Reagent F ） 微升 产品说明书 1 份 保存方式 保存反应液（Reagent D ）和底物液（Reagent E ）在－20 ℃冰箱里，避免光照；其余 的保存在4 ℃冰箱里，有效保证 6 月 用户自备 1.5 毫升离心管：用于样品制备和保存的容器 15 毫升锥形离心管：用于样品制备的容器 细胞刮脱棒：用于细胞脱离 （微型）台式离心机：用于样品操作 比色皿或酶标板：用于比色的容器 1 分光光度仪或酶标仪：用于比色分析 实验步骤 实验开始前，将－20 ℃冰箱里的试剂盒中的反应液（Reagent D ）和底物液（Reagent E ）置入冰槽里融化。然后进行下列操作。 一、 样品准备 1． 准备好 25cm2 6 细胞培养瓶或 60mm细胞培养皿的待测培养细胞（1 至 5 X 10 细胞） 2 ． 小心加入 xx 毫升清理液（Reagent A ），覆盖生长表面 3 ． 小心抽去清理液 4 ． 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：可以使用胰酶消化） 5 ． 加入 xx 毫升清理液（Reagent A ），混匀细胞 6 ． 移入到预冷的 15 毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始） 7 ． 放进 4 ℃台式离心机离心 5 分钟，速度为 300g 8． 小心抽去上清液 9 ． 加入 xx 微升裂解液（Reagent B ），充分混匀 10．转移到预冷的 1.5 毫升离心管 11．强力涡旋震荡 15 秒 12．置于冰槽里孵育30 分钟 13．放进4 ℃微型台式离心机离心 5 分钟，速度为 16000g （或13000RPM，例如 eppendorf 5415 ） 14．小心移取500 微升上清液到新的预冷的 1.5 毫升离心管