SNP筛查.docVIP

SNP筛查采用的是PCR产物直接测序法，而不应该采用PCR片段经克隆后测序的方法。因为PCR扩增过程终会出现许多错误配现象，但不可能所有的错配都发生在同一位置。PCR片段直接测序时，其结果是PCR片段众多分子的混合物的结果。如果在某一点上出现了几十次错配现象，但大多数分子（或许是几十万个分子）在这个点上应该还是正确的，在测序时，错配现象也就反映不出来了，因此，PCR片段直接测序的结果反映的是PCR用模版最原始的结果。而PCR片段经克隆后测序是测定了某一个分子的DNA序列，在几十个循环的PCR扩增过程中，很难保证某一个分子的任何点都不发生错配，PCR片段经克隆后的测序结果，往往存在一些错配的序列。Sequence analysis and editing for bisulphite genomic sequencing projects CATS法(Comparative Anchor Tagged Sequences，CATS)即比较锚定示踪序列，作为不同物种基因组共有的DNA序列，可作为比较基因组定位的锚定参考位点和界标（Lyons，1997）.CATS法选择研究较深入，标记稠密的人和哺乳动物（如小鼠）间在进化上高度保守的功能基因序列设计引物，借助PCR技术搜寻研究欠深入的其他哺乳动物基因组中的基因。 基于目标基因的CATS法主要是根据2个或2个以上的物种中已知的外显子序列设计引物，用于扩增其他物种中非编码的内含子序列。由于非编码区核苷酸的变异率明显高于编码序列，内含子区段包含的丰富的序列变异被广泛地应用于系统发生和种群遗传学分析（OpBrien et al . , 1993 ; Lyons，1997） 目前用于SNP位点检测和搜寻的技术较多（Kwok，2000；Syvanen，2001） Vinter（The sequence of the Human Genome,Science）估计，在所有的SNP中，仅仅只有2000个与氨基酸变异联系在一起。 突变热点CpG 人类基因组中有近100万个SNP位点，其中 50万个在非编码区，估计24万-40万个SNP在基因编码区，称为cSNP（coding regions SNP）,与蛋白质的功能相关。而在cSNP中估计只有2.4-4万的SNP是非同义的替换。 3．1 从现有DNA序列数据库中筛选 3．1．1 POLYBAYES计算法(polybayes algorithm) 根据SNP在表达序列标签(expressed sequence tags，EST)中的分布比在其他基因组区域中的多，即许多SNP源于EST ，应用Polybaycs软件可对任意DNA进行序列变异性的检测，Polyhayes软件检测SNP的原理及过程如下： ① 从人类基因组内某一已知序列中找山并标记其重复序列： ② 从标记的序列中挑出与EST 相匹配的片段进行重新标记； ③ 选择PSNP(SNP的预测频串．SNP probability)最小值识别并按此标准去除错误的EST； ④ 排列剩下的EST准备扫描候选SNP； ⑤设计用来证实候选SNP的序列标志位点(sequence—tagged site，STS) ⑥测单一DNA(homozygous DNA)样品的STS序列并确定候选SNP所处位置； ⑦ 在混合的DNA样品中重新对STS进行测序．若在对应位点出现 杂合的扫描峰，则可以确认其是SNP位点。Polybayes汁算法是在UNIX环境下开发来专门检测SNP的软件(http：／／ genome．W/gsc/polybayes，该方法灵敏度与SNP等位基因频率、序列准确度、EST长度及PSNP最小值的选择有关。已知序列越准确．SNP等位基因频率越高．所包含EST越短，选择PSNP最小值越大．则Polybayes计算法检测SNP灵敏度越高．可达100%。Marth等选择PSNP最小值0.4对147个EST所在序列运用Polyhayes计算法对SNP的检测率达56%，并发现了两个新的SNP位点。 3．1 2 SNP pipeline （single nucleotide polymorphism pipe line) SNP pipeline是利用信息学工具设计的检测任意DNA序列中SNP 位点存在情况的一套半自动装置．分为PHRED、PHRAP和DEMIGIACE三个部分。PHRED负责分析大量基因组序列并收集含有EST 的序列．它对序列的每个棱苷酸进行序列质量评分．按评分情况去除不准确的序 列；PHRAP进行集中排列PHRED选择的有多态位点的序列．连接色谱仪一起使用，此时选择某一个特定核苷酸．显示器即可给出其色谱仪洗峰及其位置、等位基因频率、洗峰振幅等信息．然后根据峰高的不同判定SNP位点并用红色标记：最后用D