荧光pcr的临床应用新.docVIP

荧光PCR的临床应用 多聚集链反应（polymerase chain reaction,PCR）技术发明至今已近20年了，在这期间技术得到了不断的发展，近年来出现的实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR）技术实现了PCR从定性到定量的飞跃，它以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点成为了分子生物学研究中的重要工具PCR原理 1.荧光染料 荧光基团通常各自拥有单一的光吸收峰。在光的刺激下，荧光基团吸光能许多荧光基团吸收光能后仍旧以光能形式释放能量，并且发射光的峰值大于吸收（Fluorescence resonance energy transfer，FRET）当某个荧光基团的发射谱与另一荧光基团的吸收光谱发生重叠，且两个基团距离足够近时，能量可以从短波长（高能量）的荧光基团传递到长波长（低能量）的荧光基团，这个过程称为荧光共振能量转移(FRET),实际相当于将短波长荧光基团释放的荧光屏蔽。3．荧光PCR荧光PCR不同于其他PCR的地方在于PCR过程中利用荧光染料在光刺激下释放的荧光能量的变化直接反映出PCR扩增产物量的变化，荧光信号变量与扩增产物变量成正比，并通过足够灵敏的自动化仪器实现对荧光的采集和分析以达到对原始模板量定量的目的。主要有以下几类：荧光染料直接结合扩增产物如SYBB Green I,类似于EB,能特异性地区分单双链DNA,只与双链DNA结合荧光标记引物对引物进行荧光标记从而使荧光标记基团直接掺入PCR扩增产物荧光标记探针常规引物以外，引入荧光基团标记的特异性探针，探针可与模板发生一对一结合关系Taqman双标记探针（TaqmanTM 5-nuclease assay）分子信标探针（Molecular beacon TM）LightCycler TM杂交双探针荧光标记探针的最大优点在于其特异性非常强，避免了非特异性扩增造成的假阳性信号。荧光PCR检测试剂盒主要基于Taqman技术 (TaqmanTM 5-nuclease assay)：除常规的一对引物以外，PCR反应体系中另加有一个能与PCR产物杂交的荧光双标记探针。该探针的5端标记一个荧光基团，3标记另一个荧光基团。此时5端荧光基团吸收能量后将能量转移给临近的3’端荧光淬灭基团（发生FRET），因此正常情况下检测不到该探针5端荧光基团发出的荧光信号但当溶液中有模板时，模板变性后低温退火时，引物与探针同时与模板结合。在引物的介导下，沿模板向前延伸至探针结合处，发生链的置换Taq酶的5—3’外切酶活性将探针5端连接的荧光基团从探针上切割下来，游离于反应体系中，从而脱离3’端荧光淬灭基团的屏蔽，接受光刺激发出荧光，切割的荧光基团数与PCR产物的数量成比例。因此PCR后处理2) 特异性强，灵敏度高 3) 采用对数期分析，摒弃终点数据，定量准确 4) 定量范围宽，可达到10个数量级 5) 仪器在线式实时监测，结果直观，避免人为判断 6) 可实现一管双检或多检 7) 操作安全，缩短时间，提高效率 8) 利于自动化和联网管理））））拉米夫定法昔洛韦洛布卡韦阿地福韦核苷类药物在体外或体内实验中，对HIV、HBV或 HCV等病毒有抑制作用作用机制为进入细胞内成为三磷酸化合物，通过对底物的竞争，对病毒的聚合酶或反转录酶抑制，最终抑制病毒DNA的合成和病毒增殖服用拉米夫定100mg/d,于2— 4周时血清 HBV—DNA水平明显下降，12周时 HBV—DNA累计阴转率达90％以上，52周时持续 HBV— DNA阴转率为 80％长期治疗，病毒可能出现变异HBV DNA 与HBeAg/ HBeAb的关系HBeAg阳性与HBV DNA有显著相关。HBeAg转阴往往是HBV病毒血症的消失或炎症的静息。通常认为HBeAg转阴继而出现HBe抗体的转化为乙型慢性肝炎好转稳定的标志。事实上部分感染者中 如慢性肝炎，HBeAg阴转并不意味着炎症活动的停止。HBeAg阴性的HBV感染；在另一部分感染者中如重型肝炎患者，主要以HBcAg的表达为主，感染起始即为HBeAg阴性。 由梅毒螺旋体引起。是性传播疾病中危害较大的一种疾病。症状表现多样化，且时隐时现，病情可持续很长。早期主要侵犯皮肤和粘膜，晚期侵犯心脏血管系统及中枢神经系统。梅毒可通过胎盘传给胎儿引起流产、早产、死产或分娩出先天性梅毒儿，若不经治疗半年内死亡。 1. 潜伏梅毒 感染梅毒后经一定活动期，或肌体免疫性增强，或由于治疗的影响，症状暂时消退但未痊愈，此阶段称为潜伏梅毒。将感染2年以内的潜伏梅毒定为早期潜伏梅毒，约有20%病人可发生二期复发梅毒。说明有传染性。2年以上者定为晚期潜伏梅毒，传染性较小，但10-20%可发生心血管或神经梅毒，10-15%可能 发生晚期 皮肤、 粘