微生物种群的鉴定方法选择.docxVIP

目前用于湿地微生物群落结构分析的技术主要有平板计数法、荧光染色法、Biolog微平板分析、微生物醌指纹法、磷脂脂肪酸(PLFA)谱图、荧光原位杂交(FISH)技术等。近年来，变性梯度凝胶电泳、随机扩增多态性DNA标记、单链构象多态性等方法在湿地研究中也开始应用，对湿地中微生物的研究起到显著的推动作用。以期为利用现代分子技术研究人工湿地中微生物种群净化机理提供参考。1 PCR-DGGE(Polymerase Chain Reac-tion and Denaturing Gradient Gel Electro-phoresis)1.1 DGGE 原理DGGE(变性梯度凝胶电泳)技术是由Fischer和Lerman于1979年最先提出的，主要是用于检测DNA突变的一种电泳技术。1993年Muzyers等首次将DGGE技术应用于分子微生物学研究领域。DGGE利用序列不同的DNA片段在聚丙烯酰胺凝胶中解链温度不同的原理，通过梯度变性胶将DNA分开。与其它电泳系统相比，它不是基于核酸分子量的不同将DNA片段分开，而是根据序列的不同将片段大小相同的DNA序列分开。当双链DNA分子在含梯度变性剂(尿素、甲酰胺)的聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳时，其解链的速度和程度与其序列密切相关，相同碱基对数目的双链DNA分子由于碱基对组成的不同，解链所需要的变性剂浓度也不同，当某一双链DNA序列迁移到变性凝胶的一定位置，并达到其解链温度时,即开始部分解链，解链程度越大，迁移阻力大，DNA分子的迁移速度随之减小，产生的迁移阻力与电场力相平衡时，具有不同序列的DNA片段则停留于凝胶的不同位置，形成相互分开的条带图谱。理论上只要选择的电泳条件足够精细，最低可检测到只有1个碱基差异的DNA片段。1.2 PCR-DGGE 在人工湿地研究中的应用1.2.1 微生物数量、丰度及多样性Dong等用PCR-DGGE技术鉴别分析用来处理猪圈废水的湿地基质中微生物的情况，得出菌种的分布与总磷、硝酸盐、磷酸盐的浓度显著相关，从进水到出水中微生物的多样性及丰度显著降低，其优势种为Pseudomonas sp.(假单胞菌), Arthrobac-ter sp.(节细菌属), Bacillus sp.(杆状菌)。通过系统发育分析表明一部分16S rRNA的基因序列与不可培植的反硝化细菌具有极大的相关性，而这些反硝化细菌的活动对湿地中氮的去除起着重要的作用。Yin等利用DGGE技术分析处理受污染景观湖水的三个水平潜流湿地中微生物的多样性、总的微生物群落的改变以及氨氧化细菌的组成。通过PCR对携带单加氧酶的基因序列进行扩增，得出季节的变化对微生物群落的多样性和组成具有影响；序列分析说明湿地中氨氧化细菌是不可培养的，其菌群中含有大量的亚硝化单胞菌类似序列。Guo等利用PCR-DGGE技术分析人工湿地处理二级废水后混合水中的微生物群落的结构，得出微生物菌群的多样性。Gorra等利用PCR-DGGE技术鉴别处理污水的湿地基质对氨氧化细菌群落多样性和稳定性的影响，结果表明不同基质上群落的组成没有很大的区别，其中沸石最有利于氨氧化细菌的活动。1.2.2 特定微生物功能群Drewe等通过嵌套的PCR对芦苇湿地进出水、基质及植物根区等15个位点上的Mycobacteriumavium(鸟分支杆菌)进行监测，得出芦苇湿地对鸟分支杆菌具有良好的去除作用，因而对鸟类肺结核具有有效的控制作用。Park等 (2009)通过利用实时PCR技术鉴别和定量测定分别种植菖蒲、黄睡莲、香蒲的表面流人工湿地中脱氮菌和除硫菌的活动状况。Ruiz-Rueda等通过PCR-DGGE技术鉴别了湿地中阔叶香蒲和芦苇根际的硝化反硝化菌的活动及其群落结构，并判断它与湿地中的植物种类的相关性。Huang等应用PCR-DGGE技术调查处理富营养观赏水的复合垂直流人工湿地中氨氧化细菌的多样性及活动分布的空间变更，并测定氨氧化细菌在湿地的不同层对富营养水的净化。Sundberg等将氨氧化和反硝化菌群分别用目标16S rDNA基因探针和功能基因nosZ进行PCR扩增，结果由DGGE及核苷酸序列分析，以检测用来处理高氮浓度的垃圾掩埋浸析液的人工湿地中硝化和反硝化作用及其相应的菌群。2 LH-PCR (Length Heterogeneity PCR)LH-PCR是于1998年在国外发展起来的一项新技术。在LH-PCR中，荧光标记探针被用来决定来源于不同微生物扩增序列的相对数量，带标记的片段在电泳胶上被分离出来，而后被一个带有荧光性激光的自动基因顺序分析仪所监测到。Nancy等 (2000)利用LH-PCR技术评估土壤微生物群的组成，并发现LH-PCR的结果具有可重复性。Ahn等利用LH-PCR在不同湿地植物和磷负荷下采集人工湿地基质中微生物的指纹，通过对