功能基因表达载体的构建.docVIP

天津师范大学化学与生命科学学院分子生物学期末实验报告 实验名称：功能基因表达载体的构建 11级水生生物 李雪静 1110170036 2010-1-20 实验目的：构建功能基因kazal的表达载体。 二、实验流程：基因克隆——→小片段（kazal）制备、大片段制备——→kazal基因与目标载体连接——→蛋白质的诱导表达 三、实验过程 （一）2012年6月6日上午：PCR扩增目的基因A 1.1 实验原理：PCR（polymerase chain reaction）技术是Kary Mullis 在1985年建立起来的在细胞体外合成DNA的一种方法。依DNA半保留复制原理，利用DNA聚合酶依赖于DNA模板的特性，在附加的两个引物与模板杂交之后，按碱基配对原则经酶促反应合成DNA片段，包括模板变性、引物退火及用DNA聚合酶延伸两个引物之间DNA的一定次数的重复循环，使包括在两个引物5′端限定的特异性片段形成指数式积累。整个过程操作简单，可在短时间内在小管中获得大量的特异的DNA拷贝，这一特点使PCR技术很快被应用到了分子生物学研究的广大领域。扩增DNA的特异性主要取决于引物和模板相结合的特异性，每个循环的反应分为3步： （1）模板变性（template denaturation）：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，形成游离于溶液中的单链DNA。 （2）退火（annealing）：温度突然降低，反应体系中的引物能准确地配对于被扩增区域的两个侧翼。这是因为模板分子结构比引物的结构复杂得多，而且引物的拷贝数远高于模板DNA的拷贝数，因此引物与模板DNA形成复合物的概率要大大高于模板DNA两条单链的重新结合。 （3）延伸（extension）：在DNA聚合酶、4种脱氧核糖核苷三磷酸及Mg2+ 存在的条件下，DNA聚合酶催化以引物为起始点的5′--3′DNA链延伸反应。n个循环后，一个模板得到的扩增拷贝为2n-1。 1.2 实验步骤： 以菌液为模版，进行PCR反应，扩增目标基因。 25μl反应体系为： 10× PCR buffer（Mg2+） 2.5μL dNTP 2 μL ExTaq DNA Polymerase 0.2μL 水（灭菌的去离子水） 15.875μL 模板 1μL 上游引物 1μL 下游引物 1μL 反应条件为：94℃，4min 94℃，1min 60℃，1min 25cycle 72℃，1min 72℃，10min 15℃，保温 （二）2012年6月7日 电泳检测kazal基因及回收 并把获得的kazal基因片段接入T载体 2.1电泳检测： （1）称取0.2g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入mL的μL TAE电泳缓冲液，置加热至，取摇匀，冷却到0℃左右，加入1μL，摇匀，使之完全溶解 （2）倒入插有梳子(注意不要形成气泡，凝胶厚度一般为cm左右，室温冷却3040min。待胶凝固后，取出梳子将凝胶放入电泳槽中，加入足够的×TAE电泳缓冲液，覆盖凝胶约1mm，用移液枪将已经加入μL上样缓冲液的样品和Marker分别加入到加样孔中(记录点样顺序及点样量。接通电泳仪电源(注意正负极，NA片段从负极向正极移动。将凝胶放入凝胶成像仪内观察、照相μL体积）。 （2）加入3个凝胶体积的Buffer DE-A，混合均匀后于75℃加热，间断混合（每2—3min），直至凝胶完全熔化（6—8min）。 （3）加0.5个Buffer DE-A体积的Buffer DE-B，混合均匀。当分离的DNA片段小段小鱼400bp时，需再加入1个凝胶体积的异丙醇。 （4）吸取步骤3中的混合液，转移到DNA制备管（置于2mL离心管）中，1200 ×g，离心1min，弃滤液。 （5）将制备管置于2mL离心管，加500μL Buffer W1，12000 ×g，离心30s，弃滤液。 （6）将制备管置回2mL离心管，加700μ