孟旭阳-质粒DNA测定-2012级临床医学二-第3实验室.docVIP

生物化学实验报告 姓 名： 孟旭阳 学 号： 3120100004 专业年级： 2012级临床医学二 组 别： 第三实验室 生物化学与分子生物学实验教学中心 实验名称 (Title of Experimetn) 质粒DNA的提取、定量与酶切鉴定 实验日期 (Date of Experiment) 2013-11-13 实验地点(Lab No.) 第3实验室 合作者(Partner) 谈锦萍 指导老师(Instructor) 王凌宇 总分 (Total Score) 教师签名(Signature) 批改日期 (Date) 【实验报告第一部分（预习报告内容）：①实验原理、②实验材料（包括实验样品、主要试剂、主要仪器与器材）、③实验步骤（包括实验流程、操作步骤和注意事项）；评分（满分30分）： 】 一、实验原理 （一）质粒DNA的提取（碱裂解法） 1、基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。 2、在pH值高达12.6的碱性条件下，细菌的线性染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。 3、当以pH4.8的NaAc溶液调节pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而线状染色体DNA片段不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。 （二）质粒DNA的定量（紫外分光光度计法） 1、DNA和RNA分子中由于碱基上存在共轭体系，对波长260nm的紫外光有特异的吸收峰且吸收强度与溶液中DNA和RNA的浓度成正比。 2、当=1时，双链DNA溶液的浓度为50/ml，单链RNA的浓度为40/ml。而蛋白质分子中由于色氨酸和酪氨酸的存在，其最大吸收波长为280nm，可通过测定在260nm和280nm的吸光度比值（/），估计核酸的纯度。 3、紫外分光光度法只能用于测定浓度＞0.25/ml的核酸溶液，对浓度更小的样品，可采用荧光分光光度法。 （三）质粒DNA的酶切鉴定 1、①限制性核酸内切酶是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶，是体外剪切基因片段的重要工具酶。 ②不同的质粒DNA有不同的核苷酸序列，因而其上的限制性内切酶酶切位点的位置和数量就不同，即有不同的酶切图谱。根据质粒的酶切图谱，选择合适的限制性内切酶，可以将质粒切割成线性DNA或不同大小的片段，通过鉴定酶切后的产物在电泳凝胶中的区带数以及片段的迁移率，以已知分子量的线状DNA为对照，可以判断酶切片段的大小，从而对提取的质粒进行鉴定。 2、琼脂糖凝胶电泳 ①在一定电场强度下，DNA分子的迁移取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型（相对分子质量不同的DNA片段泳动速度不一样），且DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。 ②凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子：一般来说，其中闭环结构泳动最快，其次为线性结构，最慢的可能是单链开环。 ③染色 溴化乙锭（EB）：3，8-二氨基-5-乙基-6苯基菲啶溴盐，可与DNA结合，在紫外光照射下呈现红橙荧光，有致癌性。 Gelview：荧光染料，在紫外光照射下呈现绿色荧光。 （四）聚合酶链式反应（PCR） 指在DNA聚合酶催化下，以DNA为模板，特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外复制DNA的过程。 二、实验材料 （一）碱裂解法提取质粒DNA 1、样品：细菌培养物 2、试剂：①溶液P1（细菌悬浮液），已加入RNaseA；②溶液S2（细菌裂解液）；③溶液S3（中和液）；④去蛋白液W1；⑤漂洗液W2，已加入无水乙醇；⑥洗脱缓冲液Eluent；⑦灭菌水 3、仪器及器材：①1.5ml EP管；②吸附柱，收集管；③涡旋振荡器；④微量移液器（10、200、1000） （二）质粒DNA的定量（紫外分光光度计法） 1、样品：提取的质粒DNA溶液 2、试剂：灭菌的去离子水 3、仪器及器材：①紫外分光光度计；②微量移液器（10、200）；③UVette比色皿；④1.5ml EP管 （三）质粒DNA的酶切鉴定 1、样品：质粒DNA溶液 2、试剂：①EcoRⅠ核酸内切酶；②Hind Ⅲ 核酸内切酶；③10×M酶切缓冲液；④灭菌去离子水 3、仪器及器材：恒温水浴箱；微量移液器（10）；1.5ml EP管 （四）PCR链式反应 1、试剂：①菌液：DNA模板（含靶基因片段）；②引物：正向引物、反向引物；③2×Premix；④灭菌去离子水 2、仪器及器材：①PCR仪；②微量移液器（10、200）；③0.2 mlPCR反应管 （五）琼脂糖