分子实验重点.docVIP

1. 质粒DNA的构型与电泳速率的关系？ 质粒DNA分子具有三种构型：共价闭合环状DNA（超螺旋）、开环DNA（OC构型）和线性分子（L构型）。在细菌体内，质粒DNA是以负超螺旋构型存在的。在琼脂糖凝胶电泳中不同构型的的同一种质粒DNA，尽管分子量相同，但具有不同的电泳迁移率。其中跑在最前沿的是共价闭合DNA，其后依次是线性DNA和开环DNA,其原因是共价闭合的DNA其空间位阻最小，所以跑得最快。而开环DNA空间位阻最大，所以跑得最慢。 2. 碱裂解法提取质粒DNA的原理以及三种溶液的作用？ 碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc/KAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。 （简明原理：碱裂解法是基于染色体DNA与质粒DNA变性与复性的差异而达到分离目的的。碱性使质粒DNA变性，再将pH值调至中性使其复性，复性的为质粒DNA，而染色体DNA不会复性，缠结成网状物质，通过离心除去。） 溶液Ⅰ：溶解菌体，悬浮菌体细胞 溶液Ⅱ：创造碱性环境，，裂解菌体细胞使质粒缓慢释放出来，同时使质粒DNA和染色体DNA变性 溶液Ⅲ：恢复中性环境，使变性质粒DNA复性， 3. 感受态细胞制备过程应注意的问题； 1 细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度，尽量使用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600来控制。DH5?菌株OD600为0.5时细胞密度是5×107/ml）； 2 所有操作均应在无菌条件和冰上进行； 3 经CaCl2处理的细胞，在低温条件下，一定的时间内转化率随时间的推移而增加，24小时达到最高，之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的）； 4 化合物及无机离子的影响：在Ca2+的基础上联合其他二价金属离子（如Mn2+或Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（100-1000倍）； 　5 所使用的器皿必须干净。迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率； 6 质粒的大小及构型的影响：用于转化的应主要是超螺旋的DNA； 7 一定范围内，转化效率与外源DNA的浓度呈正比； 4. 挖胶过程应注意什么？ 1. 电泳的buffer和gel都是新制的，切胶的台子清理干净，刀片最好洗净灭菌，总之一句话就是保证切下的带没有外源dna污染。③紫外灯下切下含待回收DNA的凝胶时，要衬以干净的塑料薄膜，使用无DNA污染的新刀片，其目的在于防止外源DNA的污染。 2. 切胶是要把整个目的片断所在位置的胶全部回收。为了减少胶的体积，可以用相对比较薄的胶来做，只要够点样即可，也可采用薄而宽的梳子来跑胶。 3. 关于防护，在一般有机玻璃后就足够了，戴上防护面具以保护眼睛，如果戴树脂眼镜就可以了。要是非常害怕紫外照射，或者对于胶有特殊要求，例如要求不含EB，可以采用点marker和带刻度的尺子一起照相的方法来确定目的条带在胶上的位置进行切胶。 3) 切胶时尽量只切有条带的胶，减小切胶体积：含目的片断很少的胶就不要要了，不然影响回收率。 5. 如何灭活RNase？ RNase灭活剂 玻璃器皿200℃高温烘烤2小时 塑料器皿焦炭酸二乙酯（DEPC）水溶液处理。 常用的RNA酶抑制剂 1、 焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。 它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性， 从而抑制酶的活性 从而抑制酶的活性。 2、 异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组 织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白 中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。 3、 氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和 RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。 4、 RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得 来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以 和多种RNA酶结合，使其失活。 5、 其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。 RNAsafe含有数种特殊化合物，可使RNase失活，高效去除各种溶液或者反应缓冲液中可能存在的RNase污染，从而防止RNA的降解。 6. 提取RNA和DNA时所用的饱和酚有什