分子生物学-引物设计基因组提取等.docVIP

DNA提取 1抽取1mL外周静脉血（含ACD--枸橼酸钠mol/L 加样量（g） NH4Cl 0.155 8.29 KHCO3 0.01 1.0 EDTA-Na2 0.0001 0.0372 H2O ? 1000mL 2 白细胞裂解液 WBC lysis 终浓度mol/L 加样量（g） SDS 0.1%(w/v) Tris-HCI 10mM, PH=8.0 EDTA-Na2 1mM, PH=8.0 ? 3 蛋白质沉淀剂 Potassium Acetate 5M PCR相关 Tm指的是把DNA的双螺旋结构降解一半时的温度。Cycle，25-35个即可。 最后延伸72℃，10min。 5 PCR体系：a dATP、dTTP、dCTP、dGTP四种等摩尔浓度，20-200mol/L。 b PCR缓冲液Mg2+，K+（50mmol/L）(促taq酶活性)，Tris-HCI（PH8.0）。 引物设计原则 1 引物长度18-25bp，太长特异性好，但不好扩；太短特异性差。 2 G+C含量 G+C含量45%~55%，但如果一定要G+C堆里进行扩增，需要G+C buffer， 3 3’末端与需扩的模板要完全匹配。有人说3’T比A好，也不一定。 4 引物内部不能有二级结构，引物不能互补。 5 需用BLAST进行同源性检验 6 5’末端可以进行甲基化，乙酰化，荧光标记。 引物设计相关 1文献找引物，然后通过BLAST比对 2 一般来讲质粒进行BLAST后扩增，绝对好扩。但是人类基因组的扩增有些麻烦，可以用的软件有Primer 5.0（丁香园破解版）；NCBI primer-blast(需有基因bank号相对应，不是很好用)；Primer3（在线软件，使用简单，把一定要扩增的序列括号起来即可） 3 如果是RT-PCR，扩增cDNA，需要包含内含子DNA，以检查是否有DNA污染。因此对于mRNA的反转录PCR有时候需要知道外显子长度等相关信息。 4 PCR产物长度需200~500bp。 5 Primer3 参数设置： 最小 最适 最大 Tm 53 55 63 GC 45 50 55 引物长度 20 22 27 6 人类基因组信息来源： 分子生物学NCBI：可以通过文献查找后，序列比对BLAST；Genbank；在线看临床分子生物学书等；SNP，STR，OMIM（在线孟德尔单基因遗传病的表现、检验、治疗与预防、分子生物学相关信息等？）；NCBI输入locus号—Nucleartide—基因组外显子、序列等信息均有？ 7 Primer3：Product Tm不管—Product size 200~700—输入信息 最小 最适 最大 Tm 53 55 63 GC 45 50 55 引物长度 20 22 27 — Left为上游引物—引物blast 8 NCBI blast的使用：NCBI—basic BLAST—选择一般Nucleartide blast —引物序列输入—点击blast—蓝色为完全匹配—Max Score分值越高越好， E value分值越低越好—如果22个碱基的引物，与非目标基因匹配15个以上，则需要非常小心 BLAST的使用： NCBI—basic BLAST—选择一般Nucleartide blast —引物序列输入—点击blast 以PPAR-gammaC161T位点引物： P1:5’-CAAGACAACCTGCTACAAGC-3’ P2:5’-TCCTTGTAGATCTCCTGCAG-3’ 分别输入blast进行比对为例： 一、输入P1，点击blast，出现如下结果： Transcripts是转录本的意思，一个基因的转录本可能有多个，该栏目表明P1序列与转录本的比对结果。 Genomic Sequence栏是在基因组序列中进行比对的结果。其中NT022517.18是在GRCh37.p2数据库中的结果，而NW001838877.2是在另外一个数据库中的结果。 二、点击Max Score栏目下面对应的值， 1.如在Transcripts下NM015869.4条目后面的Max Score对应的结果为： 上图中，1403代表P1（正义链）于该序列的1403处开始。 2. 点击Genomic Sequence下NT022517.18对应的Max score则给出在基因组数据库中P1正义链开始的位置 三、将反义链输入Blast中，点击NM015869.4条目后面的Max Score对应的结果为： 此时在其mRNA序列中从1580位到1599位的序列为P2链的倒转互补序列。 关于SNP 一SNP命名规则一般写法是这样: dbSNP后面跟featureID. featureI