中国人群冠心病MMP3和LTA基因.docVIP

中国人群冠心病MMP3和LTA基因 易感性的研究 1 绪论 1．1背景 此课题来源于国家人类基因组南方研究中心遗传部承担的2003年上海市重大科研项目－中国人群心脑血管疾病正常的动脉内膜附有一层非常光滑的内皮细胞。在动脉粥样硬化的早期可见到微隆起或不隆起于内膜表面的黄色点状或条状病变，其主要成分是沉积在细胞内外的脂质，此时我们称之为脂质条纹期。在机体内外环境因素的影响下，脂质条纹可自然消退或发展扩大，增生的动脉平滑肌细胞和激活的巨噬细胞可吞噬大量脂质。由于其细胞内部发生脂代谢紊乱，不能很好地代谢所吞噬的脂肪而演变成动脉粥样硬化斑块内特有的泡沫细胞。纤维组织大量增生，脂质进一步沉积，可形成明显硬化的纤维斑块，即纤维斑块期。纤维斑块的表面覆有纤维组织形成的纤维帽，深部是粥样物质的堆积（包括细胞外基质、坏死、变性的细胞、泡沫细胞及胆固醇结晶等）。病变进一步发展，动脉粥样硬化斑块可出现溃疡、出血、血栓形成、钙化等。目前一般认为，病变发展到此期已无法使其逆转。有学者认为，冠状动脉粥样斑块的溃疡，出血可能是引起顽固性心绞痛的主要机制之一；而血栓形成则是导致急性心肌梗塞不可急视的因素。EPS-300 稳压稳流电泳仪（Tanon?） 电泳板（120ml，150ml，250ml），电泳槽和12孔和24孔6ul的电泳梳 96-Well plate (ABgene) 10ul移液枪，10ul枪头（ eppendorf） 150ml，250ml锥形瓶 PB3002-S 电子天平（Mettler），称量纸 FR-200紫外与可见分析装置（上海复日科技） 2．2．2试剂 （1）EB（溴化乙锭） 由367ulEB原液加入5ml ddH2O配成 （2）PCR 产物电泳上样缓冲液 0.25%(w/v) 溴酚兰 30%(v/v) 甘油 70%(v/v) ddH2O （3）DNA 分子Marker pUC19 MspI (HpaII) Marker (用于普通PCR 电泳) (上海生工) Lambda DNA/EcoRI+HindIII (用于长片段电泳) (上海生工) （4）琼脂糖 （5）10*TBE缓冲液 Tris 107.8克＋硼酸55克＋EDTA.Na2 8.2克，加双蒸水至1000毫升，混匀溶解。 2．3 TAQMAN器材与试剂 2．3．1器材 7900HT Seuence Detection System，96-Well plate (ABgene)，384-Well plate (ABgene)，移液枪，试剂盒（包括Taqman探针，一般扩增引物） 2．3．2试剂 试剂盒（包括Taqman探针，一般扩增引物），ddH2O 3实验步骤 3．1候选基因的查找 查文献找出二个相关基因及5个SNP位点 3．1．1 LTA基因的结构和功能 基因结构 LTA基因别名为TNFSF1、TNFB、LT，它由414个腺嘌呤、735个胞嘧啶、495个鸟嘌呤、496个胸腺嘧啶组成。位于六号染色体长臂2区1带上的第三亚带上，起结构为： 图一 LTA基因结构基因功能 肿瘤坏死因子中的一种，1984年由Gray P.W 等人发现，它在炎性反应中扮演重要的角色，亦可促进次级淋巴器官的发生。基因表达物为α-淋巴毒素（淋巴毒素A）、β-肿瘤坏死因子。 mRNA序列名：NM_000595 PROTEIN：NP_000586 Genomic: NT_007592 3.1.2MMP3基因的结构和功能 MMP3基因结构 基质金属蛋白酶（MMP）是一个大家族，目前已分离鉴别出20个成员，编号分别为MMP1～20。它们是一组锌离子依赖性肽链内切酶，大小各异，底物不尽相同，能裂解维系蛋白结构的肽链，主要参与结缔组织的降解。MMPs的家族成员具有相似的结构，一般由5个功能不同的结构域组成 ［2］ :（1）疏水信号肽序列;（2）前肽区，主要作用是保持酶原的稳定。当该区域被外源性酶切断后，MMPs酶原被激活;（3）催化活性区，有锌离子结合位点，对酶催化作用的发挥至关重要;（4）富含脯氨酸的铰链区;（5）羧基末端区，与酶的底物特异性有关。其中酶催化活性区和前肽区具有高度保守性。MMPs成员上述结构的基础上各有特点。各种MMP间具有一定的底物特异性，但不是绝对的。同一种MMP可降解多种细胞外基质成份，而某一种细胞外基质成分又可被多种MMP降解，但不同酶的降解效率可不同。基因结构为： 图二 MMP3基因结构 mRNA序列名：NM_002422 PROTEIN：NP_002413 Genomic: NT_033899 MMP3基因的功能 现有研究表明MMPs活性的表达受酶原合成、酶原活化和抑制剂抑制三个水平调控。 生长因子和细胞因子等活性介质如表皮生长因子是酶原合成阶段