D0206 基因定点突变试剂盒.pdf

基因定点突变试剂盒 产品编号 产品名称 包装 D0206 基因定点突变试剂盒 10次 产品简介：  碧云天生产的基因定点突变试剂盒(Site-directed Gene Mutagenesis Kit)可 以用于点突变，多个邻近密码子的突变，单个或多个邻近密码子的缺失 (deletion)或插入(insertion) 。  本试剂盒是一个利用目前必威体育精装版的基因点突变技术设计而成的试剂盒。只 需通过基于PCR 的突变质粒的合成，和基于Dpn I 的模板质粒的消化，转 化培养以及后续的酶切或测序鉴定，即可得到预期的突变质粒(参考图 1)。累计操作时间不足2小时即可完成基因的定点突变。  参考图1，使用本试剂盒时需要先设计长度通常为30个碱基以上的互补的 两个引物，在引物中含有预期的突变位点。然后以待突变的质粒为模 板，用这两个引物进行PCR扩增反应。这样可以产生含有预期的突变位 点的双链质粒，但这个双链质粒中有两个nick位点。待突变的质粒通常来 源于大肠杆菌等细菌，在细菌中会被甲基化修饰，而在体外通过PCR扩 增得到的质粒不会被甲基化。这样用甲基化酶Dpn I处理，可以消化掉待 突变的质粒模板，而使通过PCR扩增出来的含有突变位点的质粒被选择 性地保留下来。这样把Dpn I 处理过的产物转化细菌后，质粒中有两个 nick位点可以被大肠杆菌修复，得到的克隆就会含有预期的突变质粒了。  本试剂盒提供了DH5α甘油菌，可用于感受态细菌的制备。  本试剂盒共可以进行十次基因定点突变反应。 图1. 基因定点突变试剂盒原理图 包装清单： 产品编号 产品名称 包装 D0206-1 Pfu DNA Polymerase 10μl D0206-2 Reaction Buffer (10X) 100μl D0206-3 dNTP Mix (2.5mM each) 50μl D0206-4 Dpn I 10μl D0206-5 DH5α 甘油菌 200μl D0206-6 Nuclease-Free Water 1ml — 说明书 1份 保存条件： -20 ℃保存，一年有效。 注意事项：  需自行配制LB液体培养基和LB平板以用于细菌的培养。  需自行设计和合成用于基因定点突变的引物。需自备用于细菌转化的试剂。  使用本试剂盒前请先阅读后面的常见问题。  为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 使用说明： 1. 引物设计： 用于特定基因突变的引物需要单独设计，请参考如下一些基本原则进行设计： (1) 共需设计两条互补的引物。可以先集中设计一条，然后就可以得到互补的另一条引物。 (2) 引物的长度通常为25-45个碱基。 (3) 引物中突变位点任何一侧都必需满足4X(GC碱基数) ＋2X(AT碱基数) ≥45 。但引物也不宜过长，否则通常会形成非常 稳定的二级结构。通常把突变位点两侧的碱基数控制在15个左右，且使两侧按照上述计算得到的数值相近。 例如引物为agtcaggccaattcgaagcagtcgaattgccaag，其中蓝色的aag为突变位点，则 左侧：4X(GC碱基数) ＋2X(AT碱基数) ＝4X8＋2X7 ＝46≥45 右侧：4X(GC碱基数) ＋2X(AT碱基数) ＝4X8＋2X8＝48≥45 (4) 在可能的情况下，尽量把引物的GC含量控制在40 ％-60 ％。 (5) 在可能的情况下，尽量使引物不要产生非常