人类基因组DNA的提取与鉴定.docVIP

实验一 人类基因组DNA 实验目的 1、学习基因组DNA的原理和方法。 2、熟悉应用分子生物学实验常用仪器。 实验原理 根据材料来源不同，采取不同的材料处理方法，而后的DNA提取方法大体类似，但都应考虑以下原则：（1）防止和抑制DNase对DNA的降解；（2）尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。 制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤，通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb。在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。一般真核细胞基因组DNA有107-9bp，可以从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中提取，常是采用在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提而实现的。这一方法获得的DNA不仅经酶切后可用于Southern分析，还可用于PCR的模板、文库构建等实验。 一、材料 1.5ml Eppendorf管、微量移液器与吸头、15ml离心管、三角瓶（500或1000ml）。 二、设备 三、试剂 2．0.8%（W/V）标准琼脂糖； 3．0.5×TBE缓冲液 4．其他试剂：TE缓冲液或重蒸水、氯仿/异戊醇（24:1，V/V）、异丙醇或无水乙醇、电泳加样缓冲液、溴化乙锭（EB） 四、操作步骤（酚法抽提染色体DNA） （一）DNA的提取 1. 采集口腔粘膜脱落细胞，用舌头舔颊粘膜上颚、用牙刮颊部，嘬咀，用分泌出的唾液反复漱口；将唾液吐到杯中。用生理盐水洗涤，2000rpm离心10分钟，倒掉上清；重复1次。 2. 沉淀中加1ml 1×细胞核裂解液(STE)，混匀，再加350(l STE和150(l 10% SDS，摇匀，至出现粘稠透明状。加10(l 20mg/ml蛋白酶K，摇匀。37℃温箱过夜或50℃ 3~4小时。 3．加等体积饱和酚，轻摇混匀10分钟，室温2000rpm离心10分钟，去除蛋白和SDS的沉淀。 4. 小心移上清至另一离心管，加等体积氯仿混匀5分钟，室温2000rpm离心5分钟。 5. 小心移上清，若上清不清亮透明，则用等体积氯仿再抽提一次。 6. 将上清移入另一离心管中，沿离心管壁向DNA溶液中加入2.5倍体积的无水乙醇，轻轻摇动离心管混和至体系完全均一，见白色絮状DNA。用移液器吸头挑出DNA沉淀，在新配制的70%乙醇洗二次，室温干燥5分钟，再将DNA溶于20-100(l TE中，测OD值。 7. TE溶解的DNA，在4℃下可保存一年，如要求长期保存，则需加2倍体积无水乙醇置-70℃保存。 （二）DNA的鉴定及定量 1. 比色法: DNA在260nm处有最大的吸收峰，蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中在230nm处。因此，可以用260nm波长进行分光测定DNA浓度，OD值为1相当于大约50μg/ml双链DNA。如用1cm光径，用 H2O稀释DNA样品n倍并以H2O为空白对照，根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度：DNA（mg/ml）=50×OD260读数×稀释倍数/1000。??? DNA纯品的OD260/OD280为1.8，故根据OD260/OD280的值可以估计DNA的纯度。若比值较高说明含有RNA，比值较低说明有残余蛋白质存在。OD230/OD260的比值应在0.4-0.5之间，若比值较高说明有残余的盐存在。 OD260= ； DNA的浓度=50 OD260 稀释倍数= 。 将波长换成280nm及230nm，用同一样品再次测定OD值： OD280= ；OD230= ； OD260/OD280 = ；OD260/OD230= ； 结论：所提取的DNA 。 2. 电泳鉴定 取样品1μl、电泳缓冲液5μl、6×加样缓冲液1μl（含溴酚蓝和二甲苯青FF指示剂及甘油），混匀，在0.8%琼脂糖凝胶上进行水平板微型电泳，用噬菌体λDNA作为标准。DNA区带应比较集中，泳动速度与λDNA相同或稍慢，证明分子量均 50kb。一般见不到泳动速度比溴酚蓝快的RNA区带。如果DNA不成区带，而是散开分布在λDNA与溴酚蓝之间，则说明DNA已经被降解成小分子，不能再用来进行限制性内切酶图谱分析。 五、 注意事项 酚抽提时如果上清液太黏，不能和蛋白质分开时，可加入适量STE稀释，然后再用酚抽提。 保温可在45~55℃范围内进行。 真核生物的DNA分子很大，机械张力极易引起DNA分子的断裂，因此抽提DNA时动作不可过猛；溶液转移次数