生物大分子相互作用课件.ppt

生物大分子相互作用 徐文弟 2010.9.29 分子生物学研究的重要领域 遗传中心法则 基因表达调控 细胞信号转导 关于中心法则 关于基因表达调控 关于细胞信号转导 关于ATP合酶 关于阳性菌筛选 关于生物大分子相互作用研究的关键技术 生物大分子研究相关技术 　 随着生命现象的研究逐渐由获取基因序列信息转向研究基因功能,一门新的学科———蛋白质组学应运而生。 蛋白质组是一个在空间和时间上动态变化的整体,其功能往往是通过蛋白质之间或与核酸之间相互作用而表现出来的,这种相互作用存在于机体每个细胞的生命活动过程中,相互交叉形成网络,构成细胞中一系列重要生理活动的基础。 对于蛋白质相互作用的研究就成为蛋白质组学中最主要研究内容之一 迄今已发展了包括经典的噬菌体展示技术、酵母双杂交系统以及新近发展并广泛应用的串联亲和纯化和荧光共振能量转移技术、表面等离子共振技术等多种有效的研究蛋白质间相互作用的高通量分析方法,为蛋白质组学的发展奠定了坚实的基础。 蛋白质相互作用研究当前进展 1.利用蛋白质片段互补研究其相互作用和文库筛选 2.通过核糖体展示进行相互作用的体外筛选和进化 3.利用膜上肽合成法分析蛋白相互作用 4.蛋白质成束法增强其相互作用的检测 5.用计算方法分析全基因组蛋白质的相互作用 6.通过蛋白质相互作用发展新的治疗方法 7.利用核磁共振法分析蛋白质相互作用 蛋白质相互作用的实验技术 标签融合蛋白（Labeled fusion protein） 免疫共沉淀（co-immunoprecipitation） 酵母双杂交（Yeast two hybrid system） 荧光共振能量转移技术（FRET） 表面等离子共振技术（Biacore SPR） 原子力显微镜技术（Atomic force microscopy） 噬菌体展示技术（Phage display） 酵母双杂交系统( Yeast two2hybrid system,Y2H) 　 酵母双杂交系统( Yeast two2hybrid system,Y2H)是1989年由Fields等提出并初步建立的,主要用于研究真核生物的蛋白质,到现在,双杂交系统已经成为检测和鉴定蛋白质相互作用的标准方法,并且在旨在建立一系列蛋白质相互作用关系的蛋白质组研究中扮演着重要角色。 Y2H的建立是基于人们对酵母半乳糖苷酶基因的转录激活因子GAL4的详细了解。GAL4包括两个可以独立的结构域: N 末端的DNA 结合域(DNA2binding domain,DNA2BD)和C末端的转录激活域( Transcrip tion activating domain, DNA2AD ) 。DNA2BD可以与DNA 分子的上游激活序列结合,DNA2AD则可以激活下游基因的转录,只有当两者在空间上充分接近时才会共同作用激活转录活性。 双杂交技术正是利用了GAL4的这一特点,将欲研究的两个目标蛋白的编码序列分别与GAL4的结合域和激活域的编码序列融合,构建成两个杂交系统;再将这两个杂交系统共同转化至含有报告基因的酵母细胞株;若两个目标蛋白发生相互作用,则会使DNA - BD和DNA - AD在空间上靠近进而激活报告基因的表达。 酵母双杂交系统简单快速,最常用于鉴定与已知蛋白相互作用的未知蛋白,同时也是发现新的蛋白质相互作用以及确定相互作用结构域的重要研究手段。 TRPC通道是一组Ca2 +流量调节通道蛋白,研究证明磷脂酶Cγ1 (phospholipase Cγ1, PLC2γ1)结合并控制该通道,对降低Ca2 +流量是必要的,但一直没有鉴定出它们相互作用的结构域。 Rossum等人应用Y2H系统,构建了pGBKT72BD2TR2PC3和pGADT72AD2 PLC2γ1两个载体,共同转化到酵母当中,以Lacz为报告基因,发现PLC2γ1只特异的与TRPC3相结合。实验人员又构建了载有不同氨基酸长度TRPC3 与PLC2γ1的双杂交系统,发现TRPC3与PLC2γ1的相互作用只依赖于TRPC3中对应的PH相似结构域中40～46个氨基酸,从而建立了一个广泛的信号转导模型。 融合蛋白pull-down实验 融合蛋白pull-down技术基本原理是将一种蛋白质固定于某种基质上(如Sepharose),当细胞抽提液经过该基质时，可与该固定蛋白相互作用的配体蛋白被吸附，而没有被吸附的“杂质”则