藻蓝蛋白的提取纯化及紫外可见光谱仪.docVIP

藻蓝蛋白的提取、纯化及紫外可见光谱仪 检测蛋白纯度 高相雷 实验目的 学习并掌握提取、纯化藻蓝蛋白及紫外可见光谱仪检测纯度的方法。 实验原理 冻融法：将细胞置低温下冰冻一定时间，然后取出置室温下（或40℃左右）迅速融化。如此反复冻融多次，细胞可在形成冰粒和增高剩余胞液盐浓度的同时，发生溶胀破碎。 盐析法：蛋白质在稀盐溶液中，溶解度会随盐浓度的增高而上升（盐溶），但当盐浓度增高到一定数值时，其溶解度又逐渐下降，直至蛋白质析出（盐析）。盐析的发生在于盐浓度增高到一定数值时，使水活度降低，进而导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化膜逐渐被破坏，最终引起蛋白质分子间相互聚集，并从溶液中析出。 DEAE—纤维素：二乙基胺乙基纤维素，总交换量0.9meq/g功能基：二乙基胺乙基，弱碱性阴离子交换剂。原理：含有某些功能基团，可以进行离子交换，性能比一般离子交换树脂温和，适用于分离具有生物活性的大分子，可以将性质相近的大分子物质分开。 装柱：装柱前先将层析柱垂直固定在支架上。装柱的方法分干装和湿装两种。干装是直接加吸附剂到柱中，然后倒入溶剂，此法不易将气泡排尽。湿装法是先加适量溶剂到柱中，排走其中的空气，然后把预先用溶剂浸泡好的吸附剂搅匀，随即将此悬浮液连续倾入柱中，打开柱下端出口，让溶剂慢慢流出，使柱上端悬浮液缓缓下降到需要的高度，吸附剂表面要平整，应使其一直浸没在溶剂中，以防气泡产生。 加样：经过平衡的层析柱当平衡液流到与固定相表面一致位置时，用滴管轻轻把分离样品的溶液加到固定相表面，要尽量避免冲动基质。加入样品液的体积一般应小于床体积的1/2（体积越小越有利于提高分辨率）。 洗脱：待样品液的液面流到固定相表面时，用滴管加入洗脱剂（5cm），并在柱上端与装有洗脱剂的储液瓶连接开始洗脱。同时在柱下端与部分收集器接通，立即进行分级收集（按体积或时间分管收集）。 测定：随后将收集的每管溶液进行浓度或活性测定。根据测定结果，即可绘制出洗脱曲线（以管号或洗脱体积为横坐标，以每管溶液样品的浓度或活性为纵坐标。） 实验材料 螺旋藻藻粉 实验设备 天平、量筒、塑料杯、药匙、小烧杯、铁架台、铁夹、玻棒、胶头滴管 滤纸、收集器、树枝柱、梯度洗脱器、蠕动泵、紫外可见光谱仪、磁力搅拌器、高速台式离心机 实验步骤 样品准备 取20粒螺旋藻胶囊，共10g ——加蒸馏水（100mL） ——冻融（-25℃，3~5次） ——离心沉降（10000rpm，30min，弃去沉淀）：上层液为亮蓝色含有藻蓝蛋白和一些杂蛋白，沉淀为各种细胞器呈绿色。 ——收集到亮蓝色的上清液：共65.5mL，查表并计算得（NH4）2SO4用量为7.5g，实称用量7.5g ——把（NH4）2SO4加入到上清液中：缓缓加入，及时搅拌防止局部浓度过高，溶液饱和度20% ——离心沉降（10000rpm，15min，）：上层液为深蓝色含有藻蓝蛋白，弃去沉淀（深绿色，除去部分杂蛋白） ——收集上清液：深蓝色上清液62.5mL，称量所须（NH4）2SO4 11.8g ——把（NH4）2SO4加入到上清液中：缓缓加入，及时搅拌防止局部浓度过高，得到50%饱和度的溶液 ——离心沉降（10000rpm，20min）：弃黄绿色上清液，得到亮蓝色沉淀 ——加尽量少的蒸馏水溶解沉淀 ——透析（蒸馏水，1星期，4℃） ——10000rpm，15min作用：除去变性蛋白，得到亮蓝色藻蓝蛋白粗提液 树脂准备（DEAE—纤维素预处理）及装柱 称量树脂40g ——0.5M HCl溶液150mL融胀20min ——加大量蒸馏水洗（轻轻搅拌，等树脂沉淀完全便倒掉上层蒸馏水，） ——装柱：先加适量蒸馏水排走其中空气，然后把加了蒸馏水的树脂搅匀，倾入柱中，边倾边搅拌，打开柱下端出口，让蒸馏水慢慢流出，使柱上端悬浮液下降到需要的高度。 加完后保持上部有1-2cm的水溶液存在。 ——加蒸馏水洗至中性。（以下步骤老师代做） ——0.5M NaCl—0.5M NaOH溶液融胀20min ——H2O洗至中性 ——0.02M，pH6.5磷酸缓冲液平衡（2倍床体积） 过柱 ——准备：将柱中缓冲液吸出至剩2cm时，打开下端出口，放出缓冲液至只剩1cm时，在柱中放入一小滤纸（去杂质） ——藻蓝蛋白粗提液上样吸附：开始时小心加入，以防冲动树脂，上样后,样品在柱面呈一窄的深蓝色区带, ——洗脱： 1）0.02M，pH6.5磷酸缓冲液50mL作用：除杂蛋白，洗脱过程可观察到柱中颜色自上而下为深蓝色，亮蓝色，浅蓝色，黄绿色，粉红色。（如图一所示）一较宽的淡黄色区带首先被洗脱下来,随后是较窄的深蓝色的区带 2）0.5M NaCl—0.02M，pH6.5磷酸缓冲液 ——分步收集亮蓝色部分：5mL/管，收集到的液体颜色是逐步变浅的。（如图二所示） ——得