GMsiRNA-mate转染试剂使用说明书.PDFVIP

GM siRNA-mate转染试剂使用说明书 产品介绍 与其它转染试剂比较，siRNA-mate转染效率高、细胞存活率高、毒性小。可广泛用于瞬时 和稳定转染，也可以应用于蛋白表达和基因功能的研究。 转染试剂保存在 4℃，有效期2年。 重要提示 1. 细胞的状态：转染时贴壁细胞的密度以 30-50%为佳，而且转染时细胞应处在生长旺盛 的对数生长期。细胞密度过高和细胞传代数过高会影响转染效果。 2. siRNA 的质量：使用高纯度的siRNA也是转染成功的关键。在转染前需确定siRNA 的含 量和纯度，实验过程中需要使用DEPC处理过的耗材和试剂，注意避免RNAse污染。 3. 血清的影响：在制备siRNA-mate和siRNA形成复合体过程中不能添加血清，建议用 OPTI-MEM或其他无血清培养基 （如DMEM、RPMI-1640等）稀释siRNA和转染试剂，以达 到复合物形成的最佳效果。但是，在随后的转染过程中，血清的存在并不影响复合体的 转染效果。 4. 转染试剂的用量：对于一定量的siRNA建议尝试按照推荐剂量的siRNA-mate转染试剂 进行优化，以确定最佳的转染效率。以24孔板为例，每10pmol siRNA可使用 0.5ul,1ul,1.5ul和2ul转染试剂作为初步实验条件。 操作流程 （24 孔板） 以 24 孔板为例，若要检测基因沉默的效果，推荐最低siRNA 终浓度 10nM；若要在显微镜 下从荧光强度看转染效率，因荧光信号被检测到需要一定的敏感度，推荐siRNA终浓度50nM。 遵循以下操作方法可以高效地将siRNA 转染贴壁和悬浮培养的多种真核细胞。但是对某些 特殊的细胞系和培养条件，或特殊应用等，也许需要单独特别优化，请参考表 1、表2。 A. 细胞铺板 贴壁细胞数量：在转染实验之前的 18-24 个小时，在每个孔的500ul 生长培养基中加入 4 1.5-3.5x 10 个细胞 （确保转染时细胞密度在 30-50%）。 5 悬浮细胞数量：转染实验的当天，在 500ul 生长培养基中加入 1-2x 10 个细胞。注意：转 染时应确保细胞没有过度生长或处于休止期。 B. 转染复合物的制备 1. 将 siRNA-mate 转染试剂放置于室温中，使用前轻轻混匀。 2. 将 100ulDMEM 或OPTI-MEM （无血清和无抗生素）加入无菌EP 管中。 3. 在上述含有 DMEM 培养液的EP管中加入10pmol(140ng) 待转染的siRNA，并充分混匀。 随后在管子中加入2ulsiRNA-mate 转染试剂，快速涡旋10s使其完全混匀。 4. 室温静置 10 分钟，使siRNA 和转染试剂形成转染复合物。静置时间不要超过30min。 C. 转染过程 1. 趁静置时，给24 孔板换液，每孔换上0.5ml 预热的新鲜培养基。 2. 将 100 µl 转染混合物加入孔中，终体系为600 µl，siRNA 终浓度为16.7nM。加完后将板 轻晃摇匀。 3.37℃静置培养细胞，检测基因沉默水平可在24-72h 内收样检测mRNA （RT-PCR 实验等）， 或48-96h 内检测蛋白 （WesternBlot 实验等）。 本产品仅限于科研用途，而不适用于临床诊断、治疗等其他特殊用途。 表1: 贴壁细胞或悬浮细胞接种数量、培养基体积 培养器皿 每 孔 表 面积 每孔培养基的 贴壁细胞转染前一天 悬浮细胞转染当 （cm ）2 体积 （ml） 接种密度 天接种密度1 96孔板 0.3 0.1 5 000±2 500 2-5×104 24孔板 2 0.5 25 000±10 000 1-2.5×105 12孔板 4 1 50 000±20 000 2-5×105 6孔板 10 2 150 000±50 000 0.4-1×106 60mm 20 4