酶学基本知识试验.DOC

第四章 酶学基本知识实验 体液中酶活性的测定是临床生化检验的重要组成部分，因此，了解和掌握有关酶活性测定的相关原理、方法、原则及其影响因素是十分必要的。对医学检验专业的学生而言，需要在学习了基本酶学知识与理论的基础上，通过一系列的酶动力学实验，掌握选择酶活性测定的最优条件和建立酶活性的测定方法。pH、酶浓度、底物浓度和抑制剂、激活剂等。 实验14 分离纯化小麦胚芽中酸性磷酸酶 要准确了解酶的生物学性质，必须首先将酶提取、纯化出来，然后才能研究纯酶的物理化学性质，以及进一步研究它的分子结构等。这样就必须把混合溶液中的非酶蛋白、其他酶蛋白和大分子化合物予以清除。 酶是具有催化活性的蛋白质，一般情况下分离纯化蛋白质的技术都可用于酶蛋白的分离，但分离条件较温和，多采用盐析、透析、电泳、层析及离心等技术，不损伤酶蛋白的高级结构，避免采用高温、过酸、过碱等实验条件。 【原理】 酸性磷酸酶(acid phosphatase，ACP)在自然界中广泛分布于植物种子、霉菌、以及动物肝脏和前列腺中。植物种子中的ACP在发芽时含量最丰富，随芽胚的生长ACP含量会下降。本实验选用新鲜小麦胚芽作为原料来分离和纯化ACP，具有来源方便、酶含量高等优点。 ACP能溶解于稀缓冲液和水中；溶于35%饱和度的硫酸铵溶液中，在57%饱和度的硫酸铵溶液中可沉淀析出；在中性及高温条件下不稳定，在70℃时相对稳定；pH小于6.5时稳定性增加，枸橼酸和乙酸可增加ACP酶溶液的稳定性；Mg2+、Mn2+为ACP激活剂，而Pi、Cu2+、Hg2+、Ag2+、Zn2+、Pb2+、NaF、酒石酸盐、草酸盐和甲醛等是ACP的抑制剂。从小麦胚芽中提取酸性磷酸酶的流程图见图4-1。 【试剂】 1．饱和(NH4)2SO4 溶液(pH 5.5，4℃) 按(NH4)2SO4 76.7 g加100ml 蒸馏水的比例配制。 2．1 mol/L MnCl2溶液。 3．0.25 mol/L EDTA钠盐溶液(pH 5.7)。 4．甲醇：－30℃预冷。 5．新鲜麦芽100 g。 【操作步骤】 1．小麦胚芽的准备 选取新鲜、饱满的小麦粒，冷水洗涤后，用冷水浸泡2～4d(天热时需每天换水)使麦粒发胀。将发胀的麦粒放在沥水的塑料筐中，上面覆盖湿的双层纱布，置于通风处，每天浇水2～3次以保持麦粒有一定的湿度。一般情况下，发胀的麦粒在室温20℃经3～7d就可以发出胚芽。在此过程中应注意通风透气，防止麦粒发霉。 2．取新鲜小麦胚芽100g加200ml冷蒸馏水在高速、间断条件下捣碎3～5min，得到麦芽匀浆，用2～4层纱布过滤，尽量将液体挤出，弃去纱布上固体物。 3．滤液倒入离心管，以4 000 r/min离心10min 。 4．弃去沉淀。取上清液记录体积，为上清液Ⅰ，留10ml于4℃冰箱保存，待作蛋白质和酶活性测定，剩余液体倒入烧杯中。 5．向每100ml上清液Ⅰ中加入2ml的1 mol/L MnCl2溶液，并缓慢搅拌混匀。搅拌切勿过快，以免酶蛋白变性并产生大量泡沫。 6．倒入离心管，以4 000r/min 离心10min。 7．去除沉淀。记录上清液体积，为上清液Ⅱ，留10ml于4℃冰箱保存，待作蛋白质和酶活性测定，剩余液体倒入烧杯中。 8．以54ml饱和(NH4)2SO4/100ml上清液Ⅱ的比例缓慢加入饱和(NH4)2SO4溶液，在5～10min内加完，轻轻搅拌混匀，使(NH4)2SO4浓度达到35%。加完后继续搅拌10min。 9．倒入离心管，以4 000 r/min离心10min。 10．弃去沉淀，取上清液记录体积，为上清液Ⅲ，留10ml于4℃冰箱保存，待作蛋白质和酶活性测定，剩余液体倒入烧杯中。 11．将上述液体在70℃恒温水箱中水浴至62℃ 2min，迅速用冰水浴冷却至6～8℃。 12．倒入离心管，以4 000 r/min离心10min，弃去沉淀。 13．以51ml饱和(NH4)2SO4/100ml上清液的比例缓慢加入饱和(NH4)2SO4溶液，轻轻搅拌混匀，使(NH4)2SO4浓度达到57%。 14．倒入离心管，以4 000 r/min离心10min，弃去上清液。 15．沉淀用相当于1/3上清液Ⅲ体积的蒸馏水溶解、洗涤，以4 000 r/min离心10min后，弃去沉淀，成为上清液Ⅳ，留10ml待作蛋白质和酶活性测定，剩余液体倒入烧杯中。 16．剩余的上清液Ⅳ按每ml加入0.09ml 0.25mol/L EDTA和0.1ml饱和硫酸铵溶液，在缓慢搅拌的条件下，按每ml上清液加2.0ml的比例加入甲醇(－30℃预冷)，使蛋白质析出。以4 000 r/min离心10min后，弃去上清液。 17．将沉淀用蒸馏水4 000 r/min离心10min，弃去沉淀，得到上清液Ⅴ。 小麦胚芽100 g＋