视紫红质基因克隆.docVIP

生物技术综合实验（Ⅱ）论文 bop基因克隆 专业名称：生物技术 学生姓名： 学号： 电话： 指导老师：金卫华 2016年12月 目录 生物技术综合实验（Ⅱ）论文 1 bop基因克隆 1 理论部分 3 摘 要 3 关键词 3 引 言 4 实验部分 5 实验材料 5 实验方法 6 结果与讨论 13 实验结果 13 实验讨论 1 理论部分 摘 要 方法：用小量制备质粒DNA的方法分别提取克隆型质粒载体pUC18和含细菌视紫红质基因bop的质粒pUC19，分别用限制性内切酶BamH I和Hind Ⅲ进行双酶切后,在紫外透视仪上取酶切后pUC18质粒 和Bop基因，在T4连接酶作用下，16℃恒温水浴过夜连接，再将连接后的产物导入到制备好的感受态细胞，将转化后的产物接种到含氨苄青霉素（0.1g/ml）LB琼脂平板，37℃恒温培养箱培养过夜，最后，挑取单菌落经PCR扩增后，进行1％琼脂糖凝胶电泳筛选阳性单克隆。 结果：质粒DNA琼脂糖凝胶电泳检测后，初步断定已分离提纯出不含蛋白质、RNA、脂质等杂质PUC18、PUC19质粒。酶切产物经电泳检测发现，PUC18只产生了一条荧光带，PUC19产生了两条荧光带，初步断定光带1是PUC18,光带2是Bop基因，可利用泳道②上的光带和泳道③上的光带1进行连接实验。转化结果检测显示可直接从已形成菌落的平板中挑取单菌落进行PCR扩增实验。最后，PCR回收产物检测，两泳道中的光带都位于1000-2000之间，与预测的bop基因电泳所处位置相符，初步断定bop基因已成功转入到宿主细胞。 结论：构建pUC18－bop重组细菌视紫红质基因，经特异性PCR扩增鉴定，1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，初步证实该实验实现了视紫红质目的基因（即bop基因）的克隆。 关键词 Bop基因、pUC18质粒、琼脂糖凝胶电泳、PCR聚合酶链反应 引 言 视紫红质（BR）是一种含视黄醛的膜蛋白，它位于动物视觉器官的感光细胞中，接受光讯号转变为电讯号。细菌视紫红质基因（简称bop 基因)是编码盐沼盐杆菌紫膜中细菌视紫红质分子的一段DNA 序列。BR蛋白是一个光驱动质子泵，在光照条件下能将质子从膜内传递到膜外，产生跨膜的质子梯度，将光能转变为电化学势能，从而提供生命活动所需之能量。它可以作为研究细胞膜受体蛋白的模型，有助于阐明药物与人体细胞靶受体以及信号传导途径中的受体与信号的相互作用机制；它的光驱动质子泵功能可应用在光电转换器，信号储存和光学检测等很多方面；随着生物化学、生物物理学和光学等学科的发展，BR的光致变色及光电响应特性在太阳能电池、人工视网膜、光信息存储、神经网络、生物芯片等应用领域具有广泛的应用前景，自从上世纪60年代末人们从嗜盐菌中发现BR以来，BR已成为研究得最热和最透彻的膜蛋白之一。 实验部分 实验材料 菌种 大肠杆菌DH5a(含PUC18质粒及重组质粒的两种菌) 试剂 碱裂解液Ⅰ：PH8.0GET缓冲液（50mmol/L葡萄糖，10mmol/LEDTA,25mmol/LTrisHCL） 碱裂解液Ⅱ:0.2mol/LNaOH(内含10%的SDS),用的时候需现配 碱裂解液Ⅲ：PH4.8乙酸钾溶液（60ml 5mol/LKAc,11.5ml冰醋酸，28.5mlH2O） LB培养基：蛋白胨1g、氯化钠1g、酵母提取物0.5g、蒸馏水100ml（固体培养基中加入 1.2g琼脂粉） 仪器 电子天平（上海横平仪器仪表厂，型号JY2002）、万用电炉（北京市永光明医疗仪器厂，型号DL-1）、小型号台式离心机（编号、恒温水箱、电热恒温鼓风干燥箱（编号、稳压稳流电泳仪（编号、美的冰箱（编号、摇床（编号、梯度PCR仪（编号：）、医用型净化工作台（编号：）、全自动灭菌锅（编号：）、数显恒温智能生化培养箱（编号：）、 实验方法 菌种活化 LB培养基的配置 称取蛋白胨1g、氯化钠1g、酵母提取物0.5g放于烧杯中，加适量蒸馏水搅拌溶化并定容至100ml。完全溶解后，分装到两个三角瓶中，每个三角瓶中各50ml。向其中一个三角瓶中加入1.2g琼脂粉后，塞上棉塞，并用报纸和棉线扎紧瓶口。 灭菌 将枪头、50mlLB固体培养基、50mlLB液体培养基、装有牙签的培养皿、10支试管、四个培养皿放入灭菌锅121℃灭菌20min 无菌接种 在无菌操作台中，取出LB固体培养基，待其温度降至50℃左右（不烫手）,加入50μL氨苄青霉素.混匀后，倒三个平板。培养基凝固后，分别划线接种含PUC18 、PUC19质粒的大肠杆菌菌种，编号1、2。平板倒置放在37℃培养箱中培养过夜。 挑单菌落 在无菌操作台中，取出LB液体培养基，待其温度降至50℃左右（不烫手）,加入