免疫学试验技术之间接凝集试验 .DOC

免疫学实验技术之间接凝集试验  一、 原理 将可溶性抗原(或抗体)吸附于与免疫无关的颗粒(称为载体)表面，制成诊断 试剂。当这种诊断试剂与相应抗体(或抗原)相遇时，就会发生特异性结合，在电解质的参与 下，这些致敏颗粒就会被动地发生凝集，这种借助于载体而使抗原与抗体结合发生肉眼可见 的凝集现象，就称为间接凝集试验(或称被动凝集试验)。 试验中应用的载体从中起着放大器的作用，使可溶性抗原(或抗体)的反应面积明显增大，从 而提高了反应的敏感性。具有吸附抗原(或抗体)功能的载体很多，如聚苯乙烯乳 胶、白陶土、活性炭、人和多种动物红细胞、某些细菌(如含A蛋白的金黄色葡萄球菌)等。 一种良好的载体必须具备下列条件： ①在生理盐水或缓冲液中无自凝倾向； ②大小均匀一致； ③比重与介质相似，短时间内不能沉淀； ④无化学或血清学活性； ⑤ 吸附抗原(或抗体)后，不影响其性质。 二、 凝集试验的分类 (一) 根据载体的不同分为间接血凝、间接炭凝、间接乳凝及协同凝集试 验等。 (二) 根据载体吸附免疫物质的不同分为 间接凝集试验或正向间接凝集试 验，载体的吸附物为抗原，适用于对抗体的检测；反向间接凝集试验是将免疫球蛋白吸附于 载体上，用于抗原的检测。 (三) 根据实施反应的目的不同分为间接凝集抑制试验和反向间接凝集抑 制试验。 (四) 根据实施反应时的用量及器材的不同分为试管法(全量法)、凹窝板 法(常量法或半微量法)和反应板法(微量法)。 三、 间接血凝试验(以鼻疽为例) (indirect hemagglutination test) (一) 原理若将可溶性的鼻疽抗原吸附在比其体积大千万倍的红细胞表面 上，使红细胞产生一种新的血清学性质，制成所谓的致敏红细胞，即可用以诊断鼻疽。只要 与少量相应抗体相遇，红细胞通过抗原抗体反应，即可被动地结合在一起，呈现肉眼可见 的凝集现象，阴性者红细胞由于自然沉积于孔底，则呈圆点状。这样可以明显 地提高反应的敏感性。其原理如图321。 图321间接红细胞凝集试验原理示意 图1红细胞2抗原3、5致敏红细胞4被检抗体6被凝集 的红细胞 间接血凝试验即间接红细胞凝集试验，它也存在一些缺点，例如不同批次制备的抗原或红细 胞，在敏感性和稳定性方面，可能不一致，它很容易受外界因素的影响，发生非特异性凝集 ，所以应用的器皿等就应当清洁，不要有污物或杂质等，遇到非特异凝集时，要做间接凝集 抑制试验(indirect hemagglutination inhibition test)，以排除非特异性反应。 (二) 材料和方法 1 材料 (1) 磷酸盐缓冲盐水(PBS)的配制： 甲液：Na2HPO4 213 g (或Na2HPO4·12H2O 5372 g) NaCl 85 g 乙液：KH2PO4 2042 g NaCl 85 g 上述(1)的甲、乙液配方各加蒸馏水至1000ml，溶解后，过滤，分别保存。使用时，按表3 21丙液配制表的比例将甲、乙液混合，再加等量的蒸馏水即配成015mol/L不同pH值的PB S，摇匀灭菌备用。 表321丙液：pH值64及pH值72 PBS的配 制表 pH值甲液：015mol/L Na2HPO4、NaCl(ml)乙液：015mol/L KH2PO 4、NaCl 642476 727228 (2) 1%兔血清缓冲盐水的配制：将新分离的兔血清56℃ 30min灭活后，取所 需量(如10ml)加约半量(如05ml)的洗过的压积绵羊红细胞，并加兔血清量4倍(如4m l)的pH值72 PBS，置37℃水浴箱中作用10min，以吸收兔血清中的异嗜性凝集素，1500 r/ min离心10min，吸取上清，加pH值72 PBS 95ml，即为1%兔血清PBS液，置4℃冰箱中，可 保存2天。 (3) 阿氏液(Alsevers solution)的配制：按以下配方配制，调正pH值61 ，过滤后分装小瓶，以113℃高压蒸气灭菌15min后，置4℃冰箱中备用。 枸橼酸钠(Na3C6H5O7·5H2O)08 g 葡萄糖205 g 枸橼酸00325 g 氯化钠042 g 蒸馏水加至100 ml (4) 红细胞：无菌采取绵羊血液于阿氏液中，于4℃冰箱中保存，可供3周内 使用。 (5) 固定剂：25%戊二醛溶液。 (6) 鞣酸溶液：所用鞣酸必须是优质纯品，用前用双馏水配成1/200溶液(使 用时，再用pH值72 PBS配成所需浓度)，放4℃冰箱中保存，可供一周内使用。 (7) 鼻疽抗原及被检马血清(56℃ 30m