免疫组化染色操作步骤要领.docVIP

免疫组织化学染色原理和操作步骤 一、免疫组织化学原理 免疫组织化学（IHC）又称免疫细胞化学，是根据抗原抗体特异性结合的原理，应用带有可见标记的特异性抗体作为探针，检测组织和细胞中抗原性物质的一种技术。免疫组化技术主要有直接法和间接法：直接法是以标记的一抗孵育标本以检测其中的抗原成分；间接法则先后加入一抗和二抗，形成抗原一抗二抗复合体以达到检测该抗原的目的，该法因二抗的放大作用而具有较高的敏感性。间接法常用的有过氧化物酶抗过氧化物酶（PAP）法、亲和素生物素过氧化物酶（ABC）法和链霉亲和素过氧化物酶（SP）法。 PAP法一抗和二抗均不标记，避免了标记过程对抗体活性的影响，但需要制备过氧化物酶的抗体，与适量过氧化物酶混合形成PAP复合物（含3个酶分子和2个抗体分子），染色时依次加入一抗、二抗、PAP复合物孵育标本，最后用H2O2和二氨基联苯（DAB）为底物显示过氧化物酶，即可检测标本中的抗原成分。 生物素为含硫的杂环单羧酸，可通过其羧基与蛋白质中的氨基结合，从而标记抗体和酶。亲合素又称抗生物素蛋白，与生物素有很高的亲合力，1分子亲合素可结合4分子生物素，ABC法即在此基础上建立。ABC法与PAP法相似，一抗不标记，二抗用生物素标记，染色前按一定比例将亲和素与生物素标记的过氧化物酶混合，制成ABC复合物，并使亲合素分子上至少空出一个生物素结合位点。在标本孵育过一抗和二抗后，再加入ABC复合物使其结合到二抗的生物素上，最后加入DAB进行显色。ABC法的敏感性较PAP法更高。 SP法与ABC法相似，其不同于ABC法之处在于用生物学特性与亲和素相似的链亲和素标记过氧化物酶。在标本孵育过一抗和二抗后，链亲和素标记的过氧化物酶使其结合到二抗的生物素上，最后加入DAB进行显色。与亲素相比，链酶亲和素的结合力与亲和素相似而非特异性结合较亲和素低。SP法简化了操作步骤，同时也减少了非特异性背景，是目前应用最为广泛的免疫绥化染色技术。 实验准备： ①石蜡包埋组织切片：由病理室常规处理 ②冰冻组织切片：由病理室常规处理 ③细胞爬片：将无菌盖玻片置于六孔板中，接种细胞，待细胞生长达到60％以上后取出玻片，4%多聚甲醛固定2 h。 试剂准备 ①抗体选择 单克隆抗体针对单一表位，具有较高的特异性，但在该表位破坏后将得不到阳性结果；多克隆抗体表位针对多个表位，可避免单克隆抗体的缺点，但是可能出现非特异性杂交。因此，不论选择单克隆还是多克隆抗体，最好同时购买两个货号的抗体，购买抗体时一定要明确是能够做IHC的抗体，抗体说明书上必须有IHC测试结果。如果该分子文献报道较多，可选择文献上常用的经典抗体。 ②二抗试剂盒 目前本实验室所用二抗试剂盒为Life Technologies Histostain-Plus Kit (HRP, Broad Spectrum)，货号85-9043小鼠、大鼠、兔豚鼠 目前本实验室所用为加强型DAB显色试剂盒货号DAB-2032 4. 耗材准备 免疫组化笔或者蜡笔、盖玻片、载玻片 5. 溶液配制 ①磷酸盐缓冲液（PBS） 10×PBS母液配制 NaCl 72 g Na2HPO4·12H2O 37.3 g KH2PO4 4.3g 加蒸馏水至1000 ml，充分混匀贮存。 使用时用蒸馏水10倍稀释，调整pH值至7.3—7.4。 ②柠檬酸抗原修复液 抗原修复使用柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液免疫组化操作步骤 组织片脱蜡水化 将组织片依次放入3个装有二甲苯溶液的玻璃缸中浸泡，每缸15 min ②依次放入2个装有无水乙醇的玻璃缸，每缸5 min ③依次放入2个装有95%乙醇的玻璃缸，每缸5 min ④依次放入90％乙醇、85％乙醇、75%乙醇的玻璃缸，每缸2 min，取出 ⑤放入自来水、蒸馏水的玻璃缸中清洗，重复3次。 抗原修复 将切片浸入柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中，高压煮沸后继续加热2 min，然后停止加热让切片自然冷却放入3% H2O2溶液的玻璃缸中，15 min。 ②放入蒸馏水的玻璃缸中清洗，重复3次。 放入PBS缓冲液的玻璃缸中，浸泡5 min 4. 抗体杂交 ①甩去PBS余液，将组织片平辅在湿盒中，加正常山羊血清1滴20 μl（试剂盒中的A液），28℃放置20 min，甩干 ②加稀释好的一抗1滴（20~50 μl，根据组织块大小进行调整），湿盒℃过夜。 ③置PBS缓冲液的玻璃缸中，缓慢振荡清洗5 min，更换PBS缓冲液，同法操作4次，甩干 ④加入生物素偶联的二抗20~50 μl（试剂盒中的B液，根据组织块大小进行调整），放置湿盒，37℃放置20 min ⑤置PBS缓冲液的玻璃缸中，缓慢振荡清洗5 min，更换PBS缓冲液，同法操作3次，甩干 ①加链亲和素-辣根过氧化物酶20~50 μl（试剂盒中的C液，根据组织块