大葱RAPD反应体系的优化.pdfVIP

江苏农业科学 2008年第3期 一 77一 大葱RAPD反应体系的优化 贾俊香 ，陶承光 (1．沈阳农业大学园艺学院，辽宁沈阳110161；2．辽宁省农业科学院，辽宁沈阳110161) 摘要：研究了大葱基因组DNA的提取方法，并对Mg 浓度、dNTPs浓度、引物浓度和Taq酶用量进行了优 化，建立了RAPD最佳反应体系，即2O 反应体系中10×Buffer缓冲液2 l，Mg2 浓度2．5 mmol／L，dNTPs浓度 0．22 mmol／L，引物浓度0．65 I~mol／L，Taq酶1 u(2．5 U／ 1)，模板DNA 60 ng，用灭菌超纯水补足2O l。扩增程 序为：94℃预变性3 min；94℃变性40 S，38 qC退火45 S，72℃延伸1：min，40个循环；最后72℃延伸10 rain。 关键词：大葱；RAPD；反应体系 中图分类号：Q75 文献标志码：A 文章编号：1002—1302(2008)03—0077—03 RAPD是1990年建立起来的一种分子标记技 冲液(2％CTAB；100 mmol／L Tris—HCI，pH值8．0； 术u J，具有简单、快速、费用低、不需预知研究对象 20：mmol／L EDTA，pH值8．0；1．4 mol／L NaCI；使用 的基因组序列等优点，是目前众多分子标记技术中 前加入1％p一巯基乙醇)500 ，65℃水浴1：h，期 应用最广的技术。主要应用于个体和品系鉴 间颠倒几次。(3)加入等体积(500 1)氯 异戊 定心～31基因定位 ]、构建遗传图谱 I7]、遗传多 醇(体积比24：1)，颠倒混匀至溶液呈乳浊状，不振 样性检~,lj E8-91、种问遗传分析和系统学研究 “]、 荡，打开盖子，放出由氯仿产生的气体，然后盖紧盖 标记辅助选择 等研究领域。但RAPD分析有自 子，10 000 r／rain离心10 rain。(4)将上清液转入 身的缺点，由于RAPD技术是以PCR反应为基础 …1 5 ml离心管，加入等体积氯仿／异戊醇(体积比24 的，反应体系的细微变化就可能会影响到扩增结果 ：1)轻轻颠倒数次，10 000 r／rain离心5 rain。(5)上 的重复性。一般可通过提高模板质量、控制DNA浓 清液转入1．5 ml离心管，加入2／3体积的异丙醇， 度和Mg 浓度、保持反应体系和扩增体系的一致性 颠倒混匀，一2O℃放置1 ho(6)10 000 r／rain离心 来提高结果的可靠性。本研究以大葱为材料对影响 ． 10 min，弃上清，加入350 ILl TE溶解．15：min，颠倒混 RAPD扩增反应的因素进行了探讨。 匀。(7)10 000 r／rain离心10 min，将300 ILl上清液 转入1．5 ml离心管中，加入1 ILl RNase(10 IL1)， 1 材料与方法 轻轻混匀后37℃水浴1 h。(8)取出静置，冷却至 1．1 植物材料 室温后，加入1／10体积的NaAc(pH值5．2)和2／3 供试材料大葱品种为天津五叶齐。 体积的异丙醇，颠倒混匀后一2O℃放置 1：h。(9) 1．2 试剂 10 000 r／rain离心10 min，弃上清，用70％冷乙醇清 8O条RAPD随机引物由宝生物(大连)有限公 洗沉淀2次，置于超净工作台上吹干(1—2 h)。 司合成，dNTP、Taq酶、MgC12、1