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第五章 酶动力学引论 底物浓度 酶浓度 pH 温度 激活剂 抑制剂 1.底物浓度对酶催化反应速度的影响 反应出现平衡的原因 米氏方程的意义 米氏常数为反应速度是最大反应速度一半时的底物浓度，Km单位为摩尔浓度（mol/L） Km对于特定的反应条件而言是一个特征常数。它只与酶的性质有关而与酶的浓度无关，不同的酶，具有不同的Km值。 Km值作为常数只是对固定的底物、一定的温度、一定的pH等条件而言的。 Km值可以反映酶同底物的亲和力。 Km在实际应用中的作用 鉴定酶 判断酶的最适底物 计算一定反应速度下的底物浓度 了解酶的底物在体内具有的浓度水平 判断反应方向或趋势 判断抑制类型 米氏方程的求法 Enzyme kinetics experiment 2.酶浓度对酶催化反应速度的影响 影响酶的pH稳定性因素 温度 是否存在辅助因子或其它小分子有关（Ca+） 缓冲剂的种类和浓度 底物存在与否 介质的离子强度 介电常数 pH对酶的辅助因子或活化剂稳定性的影响 温度 辅助因子 酶的pH稳定性的实验测定 在不同的试管中加入同一种缓冲液，它们具有相同体积但不同的pH 将试管置于恒温水浴中平衡 在各个试管中加入相同体积的待测定的酶液 在同一个pH和温度下测定酶的残存活力，这个pH不一定是酶的最适pH，但是酶在此pH下必须是稳定的 根据上述实验步骤所得数据，作酶的百分残存活力的对数-保温时间图 若仅测定一个保温时间后的残存酶活力，可仅作百分残存活力-pH图 pH对酶催化反应速度的影响 pH对酶的活性部位中心质子移变基团的离子化状态的影响 pH对底物离子化状态和反应的平衡位置 参与酶催化的质子移变基团 酶的最适pH 一般地说，一种酶仅在一个狭窄的pH范围内才具有最高的活力。 其他实验参数：反应的时间、温度、底物的性质及浓度、缓冲液的性质及浓度、介质的离子强度和酶制剂的纯度等。 温度对酶催化反应速度的影响 低温保藏 高温处理：灭酶 温度对酶稳定性的影响 酶分子的大小和结构 pH 离子强度 酶和体系中蛋白质的浓度 保温时间 活化剂和抑制剂 温度对酶稳定性的测定 先将酶液（不含底物）在不同的温度下保温，而其他条件保持相同 在不同的时间间隔，依次取出一定量的酶液置于冰浴中保存，或直接加入到含有底物的反应混合物中 在相同的pH和温度下（酶在此条件下是稳定的）测定残存酶活力 （只能测定酶的不可逆变性；未考虑底物可能对酶稳定性的影响） 温度对反应速度的影响 定量表示Q10=(速度）t+10/(速度)t 大多数酶催化反应Q10的范围为2－3 Arrhenius 方程式 举例 Enzyme experiment of catalase 五、抑制剂对反应速度的影响 酶的抑制剂（inhibitor）：凡能使酶的催化活性下降而不引起酶蛋白变性的物质 1、不可逆性抑制：（irreversible inhibition）抑制剂与酶的必需基团以牢固的共价键结合，从而使酶活丧失，不能用透析、超滤等去除抑制剂。 如低浓度的重金属离子Hg2+、Ag+、As3+ 可与酶分子SH结合，使酶活抑制。 重金属盐引起的巯基酶中毒可用二巯基丙醇（BAL）解毒。 农药敌百虫、敌敌畏、1059等有机磷化合物能特异地与胆碱酯酶（Choline esterase）活性中心丝氨酸残基的羟基结合，使酶失活。 可逆性抑制 1、竞争性抑制 特点 :抑制剂与底物结构相似. 抑制剂与底物结合在酶的同一位点 抑制作用可被高浓度的底物减低以至消除. Km增大,Vmax不变. 2、非竞争性抑制 3、反竞争性抑制 各种类型抑制的表观Km及Vmax Note p48 氨甲喋呤（MTX）是FH2还原酶的竞争性抑制剂，抑制人体 内FH4的合成，以致抑制肿瘤的生长。 FA FH2还原酶 FH2 FH2还原酶 FH4 若Ki=Ki’，则Vmax减小而Km不变，称非竞争性抑制。 1/V 1/S -1/Km (1+[I]/Ki)/Vmax 非竞争性抑制 特点：S、I结构不相似，结合位点不同，增加[S]反而加强抑制， Km减小，Vmax减小。 新的 Ile16 N-端可稳定 Asp194 Asp 102 His 57 Ser 195 Asp 194 Gly 193 Ile 16 +NH3 Catalytic Triad Enzyme pH Optimum Lipase (pancreas) 8.0 Lipase (stomach) 4.0 - 5.0 Lipase (castor oil) 4.7 Pepsin 1.5 - 1.6 Trypsin 7.8 - 8.7 Urease 7.0 Invertase 4.5 Maltase 6.1