派森诺回馈新老客户助力国家自然科学基金撰写.PDF

派森诺回馈新老客户：助力国家自然科学基金撰写 ——致正在撰写国家自然科学基金的各位老师的一封信 尊敬的各位老师，大家好！ 很多老师最近在致力于 2017 年国家自然科学基金的申报工作。如果您申报的项目 涉及到高通量测序技术，在申报书中的 “拟采取的研究方案及可行性分析”部分需要将 研究方法、技术路线、实验手段、关键技术等内容进行说明。如您并非专门从事高通量 测序研究，可能会对这些内容产生困惑。下面，我们派森诺生物就将最可能涉及到的几 种高通量测序产品的采集提取、建库测序和信息分析等内容进行说明，为您在国家自然 科学基金的撰写过程中提供参考。 1 微生物组测序 1.1 研究方案 1.1.1 样品采集 微生物组测序样品采集要求如下： 样品类型 样品要求 土壤类 取样后低温冻存，建议干冰运输，总量提供 1.5g 左右，如微生物含量少， 可以适当增加送样量，并备注说明，但总量不超过 10g。 排泄物类 取样后低温冻存，建议干冰运输，总量提供 0.6g 左右，液体样本约 600ul 左右，如微生物含量少，可以适当增加送样量，并备注说明，但总量不超 过 10g。 水样类 取样后低温冻存，建议干冰运输，未过滤提供 500ml 左右，已过滤好的提 供过滤相应体积水的滤膜，如微生物含量少，可以适当增加送样量。 核酸类 总量 500ng ，浓度10ng/ul ，DNA 有明显主条带，无明显 RNA、蛋白 质等污染 注 ： 如 需 其 他 样 品 类 型 的 样 品 要 求 ， 请 参 考 派 森 诺 生 物 公 司 网 站 ， 或 发 邮 件 至 市 场 部 邮 箱 （market@ ）与我们联系。 1.1.2 微生物组测序分析 （1 ）微生物组总 DNA 提取 采用 QIAamp 粪便 DNA 提取试剂盒（QIAamp DNA stool mini kit ）进行抽提（以粪便 样品为例），并对抽提的 DNA 进行检测。 采用荧光分光光 度计 （Quantifluor-ST fluorometer, Promega, E6090 ；Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit, Invitrogen, P7589 ）检测 DNA 的浓度，并用 1%的琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 的质量。调整 DNA 溶 液浓度，DNA 工作液保存于 4℃ ，储存液保存于-20℃。 （2 ）微生物组测序 以 16s rRNA 基因可变区的扩增子测序为例： 首先对 16s rRNA 基因可变区进行扩增：①针对样本 DNA 特定 V 区进行 PCR 预试验；② 大批量 PCR 扩增（Pyrobest DNA Polymerase, TaKaRa, DR500A ）；然后进行胶回收纯化： 针对目标条带进行割胶回收，得到纯化的样本（AxyPrep DNA Gel Extraction Kit, Axygen, AP-GX-500 ）；然后进行各样本定量：利用BioTek 酶标仪对各个样品定量 （BioTek Flx800 酶标仪；Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit, Invitrogen, P7589 ）；最后采用标准的 Illumina TruSeq DNA 文库制备实验流程（Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Guide ）构建所需的微生物组上机文库。 实验主要流程如下： 1 ）DNA 双末端修复：利用 End Repair Mix 中 3’-5’核酸外切酶和聚合酶的共同作用， 修复带有突出末端的 DNA 片段。 2 ） 3’端引入 “A”碱基：在修复平整的 DNA 片段 3’端引入单碱基 “A”。而在接头的 3’末端含有单碱基 “T”，从而保证DNA 片断和接头能够通过 “A”“T”互补配对连接， 并防止接头连接 DNA 片段的过程中，DNA 插入片断彼此相连。 3 ） 连接接头：在连接酶的作用下，孵育含有标签的接头与 DNA 片段，使其相连。 4 ）富集 DNA 片段：利用