鲫鱼tnfsf13b（baff）基因的克隆、可溶性表达及生物学功能分析.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１６，３６（１２）：２１２７ ＤＯＩ：１０．１３５２３／ｊ．ｃｂ 鲫鱼ＴＮＦＳＦ１３ｂ（ＢＡＦＦ）基因的克隆、可溶性 表达及生物学功能分析 １ ２ ２ ２ ２ 裴丽丽 　黄　芳 　李瑰婷 　庞书英 　任文华 （１南京医科大学康达学院　连云港　２２２０００　２南京师范大学生命科学学院　南京　２１００４６） 摘要　目的：获得鲫鱼Ｂ细胞活化因子（ＢＡＦＦ）基因的全长序列，并构建鲫鱼Ｂ细胞活化因子 （ＢＡＦＦ）基因的可溶性表达体系，研究其蛋白表达产物对鲫鱼Ｂ淋巴细胞的作用。方法：通过ＲＴ ＰＣＲ技术克隆鲫鱼ＢＡＦＦ（简称ＣａＢＡＦＦ）的全长ｃＤＮＡ序列，并利用ＲＡＣＥ技术快速扩增ｃＤＮＡ 末端，将ＣａＢＡＦＦ的可溶性片段（简称ＣａｓＢＡＦＦ）与表达载体ｓｕｍｏ连接，并在大肠杆菌ＢＬ２１中高 效表达和纯化，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ对产物ＮｕｓＨｉｓＣａｓＢＡＦＦ蛋白进行鉴定。激光扫描共聚焦显微镜 分析表明，ＮｕｓＨｉｓＣａｓＢＡＦＦ蛋白可以与鲫鱼Ｂ淋巴细胞结合。体外，通过 ＭＴＴ检测纯化的Ｎｕｓ ＨｉｓＣａｓＢＡＦＦ蛋白能否促进鲫鱼Ｂ淋巴细胞的存活。结果：成功克隆鲫鱼ＢＡＦＦ基因，构建了重 组表达载体，获得可溶性 ＮｕｓＨｉｓＣａｓＢＡＦＦ蛋白。体外实验证明，可溶性 ＮｕｓＨｉｓＣａｓＢＡＦＦ蛋白 能够促进鲫鱼Ｂ淋巴细胞的存活。结论：可溶性ＮｕｓＨｉｓＣａｓＢＡＦＦ蛋白能够促进鲫鱼Ｂ淋巴细 胞的存活／增值，为鲫鱼免疫系统的研究奠定了基础。 关键词　ＢＡＦＦ　鲫鱼 （Ｃａｒａｓｓｉｕｓａｕｒａｔｕｓ）　ＲＡＣＥ　细胞活性 中图分类号　Ｑ７８９ ［１１］ 　　ＢＡＦＦ（Ｂ细胞活化因子，也被称为ＢＬｙＳ，ＴＡＬＬ１， 外结构域是具有生物活性的可溶性因子 。目前研究 ＴＨＡＮＫ，ｚＴＮＦ４，或ＴＮＦＳＦ１３ｂ）是一种新型的肿瘤坏死 结果表明，ＢＡＦＦ促进 Ｂ细胞发育和存活的受体主要 因子家族的配体，属于 ＴＮＦ（肿瘤坏死因子）家族成 ［１２］ 是ＢＡＦＦＲ 。 ［１４］ 员 。ＴＮＦ家族成员及其受体在免疫系统中起重要作 　　鲫鱼在亚欧地区是一种非常流行的商品鱼，由于 ［５］ 用 。而 ＢＡＦＦ在 Ｂ细胞存活，增殖和分化中起着主 它们具有生长迅速，高效的饲料转化率和较高的市场 要作用［６］。ＢＡＦＦ是一种 型膜结合蛋白，经弗林蛋白 价值，所以是重要的水产养殖品种。在国内，鲫鱼具有 Ⅱ ［７］ 很高的市场价值，是养殖业的主要品种之一。目前，鲫 酶水解后可以获得可溶性的三聚体配体 。非淋巴细 胞（唾液腺上皮细胞，星形胶质细胞和成纤维样滑膜细 鱼的遗传和免疫学知识很少有人研究，所以对鲫鱼的 胞）和上皮细胞包括支气管和鼻腔上皮细胞可以诱导 免疫学研究有助于养殖业的发展。我们成功克隆了鲫 ＢＡＦＦ蛋白的分泌，但 ＢＡＦＦ蛋白主要由骨髓细胞（巨 鱼ＢＡＦＦ的全长ｃＤＮＡ序列。构建了重组表达载体，获 噬细胞，单核细胞和树突状细胞）分泌［８１０］。先天免疫 得可溶性ＮｕｓＨｉｓＣａｓＢＡＦＦ蛋白。体外实验证明，可溶 细胞和某些淋巴细胞分泌的ＢＡＦＦ蛋白在免疫应答中 性ＮｕｓＨｉｓＣａｓＢＡＦＦ蛋白能够促进鲫鱼 Ｂ淋巴细胞的 发挥重要作用。ＢＡＦＦ氨基酸序列与ＡＰＲＩＬ（增殖诱导 存活。 配体）具有３３％的相似度，与ＴＮＦ具有２０％的相似