单核细胞增生性李斯特氏菌hly基因的克隆表达.pdfVIP

· 2 · 中国奶牛 ·2008年第 11期 单核细胞增生性李斯特氏菌hly基因的克隆表达 刘海瑞．付世新。罗春海 (黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆 163319) 中图分类号：Q344．13 文献标识码 ：A 文章编号：1004—4264(2008)11-0002-03 摘要：以单核细胞增多性李斯特 氏菌(ListeriaMonocytogengs，LMO)LM0—0586基因组DNA为模板，运用PCR扩增 得到片段大小为 1646bp的致病基因李氏溶血素(hly)~因，并克隆到pMD18-T载体上，构建克隆载体pMD18-T-hly。 经测序正确后，将 hlv基因克隆至表达栽体 pGEX上构建表达质粒pGEX一6P一1一hly。在 IPTG诱导下，携带pGEX一 6P一1一hlyA的EcoliBL21(DE3)高效表达分子量约为82KDa的可溶性蛋 白及包涵体形式的蛋白。为进一步研究溶 血素蛋 白的结构、功能．LMO的分子流行病学调查、诊断试剂盒的开发提供依据。 关键词：单核细胞增多性李斯特氏菌；hly基因；克隆表达 CloningandExpressionofhlygenefrom ListeriaMonocytogengs LiuHairui，FuShixin，LuoChunhai (CollegeofAnimalScienceandTechnology，HLJAugustFirstLandReclamationUniversity，Daqing 163319) Abstract：TheblygenewasamplifiedbyPCRwiththegenomicDNAofListeriaMonocto n LMO-0586asthetemplate．Thehlygenewas insertedinpMD18-TtoconstructtherecombinantcloningvectorpMD-hly．AftertheDNA sequencewasdetermined，thehlyAwassubcloned intoexpressionvectorpGEXtoconstructtherecombinantexpressionvectorpGEX-6P-I-hly．UponIPTGinduction,solublehlywasover-produced byE．coliBI21(DE3)harboringtheexpressionconstruct．Recombinantshowedasinglebandabout82KDaonSOS—PAGEge1． Keywords：ListeriaMonocytogengs；hlygene；Cloneexpression 李氏杆菌病又称 “旋转病”，青“贮病”．是一种重要 公司。引物 (上游引物 ：5’一GCGGATCCAGAGTGAAACC 的人畜共患传染病 ．主要由单核细胞增生性李斯特氏菌 CATGAAAAAAATAATGC一3’：下游引物 ：5’一GCGTCGA (ListeriaMonocytogengs，LMO)引起，呈世界范围分布。 C，丌ATrCGATFGGATFATCTACACTA1TI’A一3’)由上海生 该菌属于细胞内寄生的革兰氏阳性杆菌 ．可导致人和动物 工生物工程有限公司合成 患脑膜炎、败血症及流产等Il1，病死率可高达30％~7O％四。 1．2 试验 方 法 本实验利用分子生物学方法对 LMO致病基因hlv进行克 1．2．1 LMODNA的提取 隆表达，为进一步研究溶血素蛋白的结构、功能，LMO的 具体步骤参照分子克隆实验手册进行 分子流行病学调查、诊断试剂盒的开发奠定基础。 1．2．2 hly基因片段的克隆 1 材料与方法 扩增 hly目的DNA片段，PC