海洋假别单胞菌CY24的琼胶酶基因的克隆、重组表达及酶学性质分析.pdfVIP

海洋假别单胞菌CY24的琼胶酶基因的克隆、重组表达及酶学性质研究 海洋假别单胞菌CY24的琼胶酶基因的克隆、重组表达 及酶学性质研究 摘要 随着糖生物学和化学研究的发展，近几年来人们发现不同聚合度的琼胶寡糖 具有重要的药用价值，如抗肿瘤、抗感染、抗氧化等，有望发展为新一代海洋 药物和功能食品，具有强大的市场竞争力和广阔的发展前景。传统的琼胶寡糖制 备方法是琼胶的化学稀酸水解法，该方法的裂解产物分子量不均一，难以得到足 量的低聚糖纯品。而琼胶酶降解底物的专一性强，有利于单一低聚糖的制备。然 而目前已发现的琼胶酶不但活性低。而且亡物特异性较差，成为制约琼胶寡糖构 效关系和应用研究的瓶颈因素。因此，高活性、高特异性的琼胶酶的发现具有 重要理论意义和广阔应用前景。 本论文利用琼胶作为唯一碳源的选择性培养法从海水中分离得到l株高产琼 胶酶的菌株，通过形态观察、生理生化实验以及16SrRNA序列分析，鉴定该菌株 2．5％、干酪素 sp．)CY24。经发酵条件优化确定最适培养基配方为(w／v)：NaCl 0．25％、 0．5％、KCl 0．02％、 0．002％、CaCl2 MgS04·7H20 0．1％、FeS04‘7H20 酶液的酶活最高可达1．8U／ml，较优化前提高了20倍。 利用鸟枪法从Pseudoalteromonas sp．CY24中克隆到1个琼胶酶基因(agaA)。 首先提取Pseudoalteromonas I和HindlII sp．CY24的基因组DNA，分别利用Pst 进行条件性酶切，回收2．5．7．0 coli 转化EscherichiaDH5a，建立基因组文库。利用琼胶唯一碳源培养基结合蓝 白斑筛选得到9株具有琼胶酶活性的阳性重组子，对其中1株的重组质粒pA5进 行测序，测序结果表明，pA5中插入了包含琼胶酶基因在内的共3．5kb的外源片 断。根据生物信息学分析和亚克隆的建立，确定了琼胶酶基因的开放阅读框架为 分子量为50．8 kDa，pI值为6．07。agaA基因的序列分析表明：在起始密码子上游 具有SD序列及启动子序列中较为保守的．10区和-35区，在翻译的终止密码子下 kcal， 游25个碱基处出现9个碱基的反向重复序列，形成发夹结构的自有能为-12．9 具有典型的不依赖于p因子的终止子的序列特征。用SignalP在线分析软件对agaA 翻译产物N端的前50个氨基酸进行信号肽预测，发现前23个氨基酸具有信号肽 的特征，蛋白质合成后，通过在23位和24位氨基酸之间进行切割而形成最终的 成熟蛋白。用CLASTALW系统对该琼胶酶与其它已知琼胶酶进行氨基酸序列同 海洋假别单胞菌CY24的琼胶酶基因的克隆、重组表达及酶学性质研究 源性分析，并未发现有显著相似性的序列(序列一致性不大于40％，序列相似性 不大于75％)，证明本文克隆的agaA是一种新的琼胶酶基因。该序列已提交 GenBank，登录号为AYl50179。 个组氨酸的标签(6XHis·Tag)。利用化学转化法将构建的琼胶酶表达载体转入 E．coli 中出现了大量诱导表达的重组蛋白，超声波破碎上清液有明显的琼胶酶活性。经 镍离子柱分离纯化后，SDS．PAGE检测为单一条带，说明已达到电泳纯。重组琼 胶酶的理化性质与根据氨基酸序列的理论推测值基本一致。 重组琼胶酶的基本酶学研究表明，酶的最适pH为6．5，pH稳定范围较大 (4．10)：最适温度为40℃，在40℃以上时酶活力迅速衰减；最适底物琼脂糖浓度 为O．25％。利用TLC法(Thin Layer 行研究，结