抗oh8dG单克隆抗体的制备及生物学特性分析.pdfVIP

浙江大掌硕士研究生论文 抗8．羟基．2，．脱氧鸟苷(oh8dG)单克隆抗体 的制备及生物学特性研究 浙江大学医学院 免疫学专业 建 2000级硕士研究生王 导 师 沈建根 ， 中文摘要 | ／氧化剂作为线粒体电子转移、炎症反应、有氧代谢过程的副产品，在体内不 断产生，尽管机体的酶促和非酶促抗氧化防御体系可保护细胞免受氧化损伤，但 仍有一些氧化剂逃避了机体的防御机制而造成大分子损伤，包括蛋白质、脂质、 DNA、RNA。DNA的氧化损伤与老化，年龄相关的退行性疾病以及肿瘤的发生 有着密切关系。 的兰壅!堕箜，通过酶标记技术检测oh8dG在组织和细胞中的表达，建立一种快 速、敏感、特异而简便的oh8dG检测方法，探讨oh8dG在疾病的发生和发展过 程中所起的作用。 ／ ／1 L 碳二亚胺，避光，4C搅拌过夜，用生理盐水透析平衡，浓缩至lml体积，加50％ 甘油一20。C保存，即制成BSA。oh8dG偶联物，BSA．G按同样方法制备。 乳化，第2、3次免疫以弗氏不完全佐剂乳化，背部皮内多点注射，每周1次， u 每次o．2ml(含偶联物60 g)，1月后加强免疫1次，4天后取脾细胞与SP2／0细 胞在50％聚乙二醇作用下融合，经HAT选择性培养。2周后用ELISA间接法筛 浙江大掌硕士研究生论文 选阳性杂交瘤，选择抗BSA—oh8dG阳性而抗BSA—G、BSA阴性的杂交瘤细胞， 并予以有限稀释克隆化培养，直到克隆化细胞抗体阳性率为100％。杂交瘤细胞 接种经液体石蜡预处理过的BALB／C小鼠腹腔，两周后收集腹水，离心后取上 blot证实该单抗有较 清，一20。C保存。ELISA测定腹水效价为1：16384，Western 好的特异性，竞争性ELISA测定单抗的交叉反应率10％。 3胃粘膜组织oh8dG测定：以单克隆抗体作免疫组化检测oh8dG在慢性浅 表性胃炎组织中的表达，免疫组化结果显示，20例Hp阳性的慢性浅表性胃炎组 织中有11例为阳性表达，阳性率为55％；20例Hp阴性的慢性浅表性胃炎组织 水平有显著性差异。 分成4组，其中3组加入H202，使之终浓度为4mmol／L，另外一组作对照，分别 于4h、6h、9h取细胞涂片(载玻片预先用多聚赖氨酸处理)，镜下检查细胞密度 以排列较密但不重叠为宜，待涂片略干后用冷丙酮固定15rain，取出自然干燥后， 进行免疫细胞化学检测。结果显示。在正常的HL．60细胞中。ob8dG表达最低， IlL一60细胞经过氧化氢处理6h，ohZdG表达最高，不同阶段的。舻dG表达水平有 显著性差异(Radit分析，P0．05)。 5抗oh8dG单克隆抗体酶联免疫检浈4法的建立：以不同浓度的oh8dG标准 品作为检测标本，绘制标准曲线，建立了检测oh8dO的竞争性ELISA。结果表 明，该方法特异、敏感(10ng／m1)、重复性好(变异系数10％)。j户L ／ 结论： l 制备的抗oh8dG的单克隆抗体能特异识别oh8dG。 2 Hp感染可使胃粘膜中的0h8dG水平升高，并且阳性表达主要在胞浆， oh8dG作为一突变剂，可能在Hp感染引起的胃癌中起着重要作用。 3 眦一60经外源性过氧化氢作用后，oh8dG表达水平增高，不同阶段的 oh8dG表达水平有显著性差异。 4 竞争性ELISA具有灵敏度高、特异性强的特点，可望成为临床检测ohadG 的试剂盒。 浙江大掌硕士研究生论文 ofmonocl