第二课酶的生产与分离纯化2.pptVIP

第二章 酶的生产与分离纯化 主要内容 酶分离、纯化的评价 酶的剂型与保存 酶的分子结构与催化功能 4 酶分离、纯化的评价 酶经分离、纯化后要确定该纯化步骤是否适宜，必须经过对有关参数的测定及计算才能确定。酶的产量是以活力单位表示，因此在整个分离过程中每一步始终贯穿比活力和总活力的检测、比较。 基本概念1 酶活力(Enzyme activity)：酶活力是指酶催化反应的能力，它表示样品中酶的含量。 1961年国际酶学会规定：l min催化lμmol分子底物转化的酶量为该酶的一个活力单位 ( 国际单位 ) ，温度为25 ℃，其它条件 (pH、离子强度) 采用最适条件。 酶的总活力为样品的全部酶活力。 总活力 = 酶活力 × 总体积 (mL) 或 = 酶活力 × 总质量 (g) 比活力 (Specific activity) ：比活力是指单位蛋白质 (毫克蛋白质或毫克蛋白氮) 所含有的酶活力 (单位/毫克蛋白) 。 比活力是酶纯度指标，比活力愈高表示酶愈纯，即表示单位蛋白质中酶催化反应的能力愈大。 但是，比活力仍然是个相对酶纯度指标。要了解酶的实际纯度，尚需采用电泳等测定方法。 回收率 (Yield percent) ：回收率是指提纯前与提纯后酶的总活力之比。它表示提纯过程中酶的损失程度，回收率愈高，其损失愈少。 提纯倍数：提纯倍数是指提纯前后两者比活力之比。它表示提纯过程中酶纯度提高的程度，提纯倍数愈大，提纯效果愈佳。 酶纯化评价实例 5 酶的剂型与保存 酶制剂通常有下列四种剂型： 液体酶制剂 固体粗酶制剂 纯酶制剂 固定化酶制剂（见书中第五章） 5.1 液体酶制剂 包括稀酶液和浓缩酶液。一般除去固体杂质后，不再纯化而直接制成，或加以浓缩而成，一般需要加稳定剂。这种酶制剂不稳定，且成分复杂，只用于某些工业生产。 5.2 固体粗酶制剂 发酵液经杀菌后直接浓缩或喷雾干燥制成。有的加入淀粉等填充料，用于工业生产。有的经初步纯化后制成，如用于洗涤剂、药物生产。用于加工或生产某种产品时，务须除去起干扰作用的杂酶，才不会影响质量。固体酶制剂适于运输和短期保存，成本也不高。 5.3 纯酶制剂 包括结晶酶，通常用作分析试剂和医疗药物。要求较高的纯度和一定的活力单位数。用作分析工具酶时，除了要求没有干扰作用的杂酶存在外，还要求单位质量的酶制剂中酶活力达到一定的单位数。用作基因工程的工具酶要求不含非专一性的核酸酶，或完全不含核酸酶， 酶的保存方法 (1) 温度。 (2) pH与缓冲液。 (5) 为提高酶稳定性，常加入下列稳定剂： ① 底物、抑制剂和辅酶，它们的作用可能是通过降低局部的能级水平，使酶蛋白处于不稳定状态的扭曲部分转入稳定状态。 ② 对巯基酶，可加入－SH保护剂。如二巯基乙醇、GSH(谷胱甘肽)、DTT(二硫苏糖醇)等。 ③ 其他如Ca2+能保护α－淀粉酶，Mn2+能稳定溶菌酶，Cl－能稳定透明质酸酶。 6 酶的分子结构与催化功能 6.1 酶分子组成 1. 酶蛋白 虽然少数有催化活性的RNA分子已经鉴定，但几乎 所有的酶都是蛋白质。 酶蛋白有三种组成形式：①单体酶，仅有一个活性 部位的多肽链构成的酶分子质量为13～35 k Dalton， 为数不多，且都是水解酶；②寡聚酶，由若干相同 或不同亚基结合而组成的酶，亚基一般无活性，必 须相互结合才有活性，分子质量为35 k Dalton以上 到数百万单位；③多酶复合体，指多种酶进行连续 反应的体系。前一个反应产物为后一反应的底物。 2. 辅基或辅酶 仅有少部分酶是由单一蛋白质所组成，而大部分酶 则为复合蛋白质，或称全酶，是由蛋白质部分(酶蛋 白)和非蛋白质部分所组成，即酶蛋白本身无活性， 需要在辅因子(Cofactor)存在下才有活性。 有机辅因子可依其与酶蛋白结合的程度分为辅酶 (Prosthetic enzyme)和辅基(Prosthetic group)。 （1）铁卟啉 铁卟啉是细胞色素氧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶等氧化酶的辅基。　　　 氧化酶的铁卟啉的功能在于靠铁的价电子变化 （Fe2+→Fe3++ｅ）来传递电子，催化氧化还原反应。 （2）黄素核苷酸 (FMN和FAD等) 黄素核苷酸为维生素B12 (核黄素) 的衍生物，为黄素酶类 (如氨基酸氧化酶、琥珀酸脱氢酶等) 的辅基。　　　 在酶的催化作用下，FMN和FAD的功能是传递氢(传递质子和电子2H→2H++2e)，亦称氢载体而自成氧化－还原体系，反应主要表现在6,7－二甲基异咯嗪基团中的第1位及第10位N原子的脱氢与加氢。其反应式如图3－3。 （3）烟酰胺核苷酸(NAD及NADP) 烟酰胺核苷酸是许多脱氢酶 (如异柠檬酸脱氢