泥蚶血液est文库的构建、标注和分析-包永波 - 宁波市科协.docVIP

泥蚶血液EST文库的构建、标注和分析 包永波，林志华 浙江万里学院，生物与环境学院，中国，浙江，315100 摘要：泥蚶是我国养殖贝类的主要经济品种。和其它养殖贝类相比，泥蚶关于功能基因及分子生物学的研究较少。为了研究泥蚶的免疫，生长和血红蛋白相关基因，我们构建了泥蚶血细胞均一化cDNA文库。从文库中获得了2278个EST序列，它们来自1501个平均长度为459 bp的cDNA克隆的5’末端。这些EST序列的聚类分析确定了1501个单一标注基因（Unigene），其中包含173个重叠序列(Contig)和1328个单一序列(Singleton)。基于NCBI的非冗余数据库的比较，在这些和已知基因匹配的序列中，Unigene被分为六大类，142（29.0％）与代谢相关，128（26.3％）与细胞结构/运动相关，94（19.2％）与基因/蛋白质表达相关，61（12.5％）与细胞信号/传导相关，50（10.2％）与细胞/机体免疫相关，14（2.8％）与细胞分裂相关。使用BLAST将所有的重叠序列和单一序列与公共蛋白质数据库进行比对， 并对感兴趣的免疫、生长或血红蛋白相关基因进行了解析。这些基因资源为和表达芯片的开发奠定了基础。1.简介 泥蚶是亚洲东部沿海包括从南韩到马来西亚，尤其是中国东部的主要养殖贝类和重要经济水产品种。目前有大量文献报道泥蚶的繁殖[1]，生长[2,3]，生理 [4,5]，生化[6-9]，生物标志物[10-12]和疾病[13,14]的研究。然而，关于泥蚶基因组和分子生物学方面的研究甚少。到目前为止，还没有EST序列发布，只有两个编码蛋白质的mRNA序列（细胞色素氧化酶亚基和金属硫蛋白）提交到基因库中[11]。对于遗传背景知之甚少的如泥蚶，cDNA文库构建和测序对获得大量遗传和功能基因方面的信息来说是一种方式[15]。由于疾病暴发、种质衰退和环境污染等原因[7,12 -14]，泥蚶正面临着严重的问题。 在中，血细胞被认为是免疫细胞，并且研究表明当生物体遭受微生物或病毒攻击时[16,17]，血细胞中存在涉及免疫防御反应的酶和分子。此外，许多生长激素和生长因子在血液中表达和运输。因此，开展泥蚶生长与免疫相关基因的研究，对于泥蚶分子设计辅助育种和养殖的可持续发展来说非常重要。这些基因可用于分子标记辅助免疫制剂的开发[18]。此外，研究泥蚶这一独特的血红蛋白基因也是构建血细胞cDNA文库的另一个重要原因。本文为了泥蚶与，生长及与血红蛋白相关的主要基因，我们分析了2278个从泥蚶血细胞中获得的EST序列。第一个泥蚶血细胞cDNA文库的成功构建，为进一步的EST分析、功能基因的表达和克隆、SNP分子标记开发利用、种质资源评价和分子设计育种等奠定了基础。 2.材料和方法 2.1动物及RNA制备 泥蚶采自宁波象山的养殖场，并在取样前将其置于充气海水中48小时。用2毫升注射器从成蚶（约3厘米长的）体腔中抽取1.5毫升血淋巴，置于100毫升海洋抗凝液中（0.45 M氯化钠，0.1 M葡萄糖，30m柠檬酸钠，26柠檬酸，10 mM EDTA的，pH值4.6）。然后将收集的血淋巴样品立即2000 x g离心3分钟，收集血细胞。按照使用说明用Trizol试剂（Invitrogen公司）从血细胞样本中提取RNA。使用Oligotex mRNA的试剂盒（QIAGEN）从总RNA中提取Poly (A)+ RNA。然后通过琼脂糖凝胶电泳和A260/A280比率检查总RNA和poly (A)+RNA的质量。 2.2均一化cDNA文库的构建 使用Creator Smart cDNA文库构建试剂盒（Clontech公司）合成cDNA的第一链。使用分光光度计测定总RNA的浓度。对于cDNA的第一链的合成，每1μg RNA需要1μl的SMART IV寡核苷酸（Clontech公司）和1μl CDSIII/30-PCR引物。此反应在72℃条件下孵育2分钟后，随后立即在冰上冷却2分钟。接下来，将2μl 5x第一链缓冲液，1μl的DTT（20mM）,1μl dNTP mix（10mM），1μl的PowerScript逆转录酶添加到管中，在42℃条件下孵育1小时。采用长距离PCR扩增（LD- PCR）方法，cDNA的第一链通过热启动立即扩增。然后将 2μl cDNA的第一链作为100μl SMART cDNA扩增反应体系的模板，进行 16个PCR循环。接着将5μl PCR产物进行1.5％琼脂糖/ ETBR凝胶电泳。 然后使用TRIMMERDIRECT套件（Evrogen）筛选富含全长序列的cDNA以及定向克隆。对278个克隆进行PCR分析，通过确定重组体与非重组体的比例和cDNA插入片段的平均大小来评估cDNA文库质量。对cDNA文库进行切割，包装噬菌体在ExAssi