药学分子生物学（唐晓波）第四节 真核细胞表新.pptVIP

复习 *一个完整的表达系统通常包括配套的 表达载体（Expression vector） 表达菌株。 一、*表达载体 包涵体 在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体（Inclusion Bodies，IB）。 *包涵体表达形式的优点 在一定程度上保持表达产物的结构稳定：能够避免细胞内蛋白水解酶的作用，有利于目标蛋白的富集 简化外源基因表达产物的分离操作：包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片和细胞成分，菌体经超声波裂解后，直接通过高速离心即可将重组异源蛋白从细菌裂解物中分离出来 能够表达对大肠杆菌宿主有毒或有致死效应的目标蛋白。 可溶性蛋白质的分离纯化 与纯化包涵体相比，细胞质中以可溶性形式表达蛋白质的分离纯化过程比较复杂，一般要通过亲合层析才能达到比较高的纯度。 常用的与目标基因融合表达的序列 金黄色葡萄球菌蛋白G、A和衍生物Z，日本血吸虫谷胱甘肽-S-转移酶，大肠杆菌麦芽糖结合蛋白，His-tag 等是目前常用的与目标基因融合表达的序列。 第四节 真核细胞表达系统 原核表达有3个缺点 缺翻译后修饰 易形成包涵体 有些表达水平低 主要内容 一、酵母细胞表达系统 二、昆虫细胞表达系统 三、哺乳动物细胞表达表达系统 一、酵母细胞表达系统 酵母菌的特点 遗传操作相对简便； 具备蛋白质翻译后加工和修饰系统； 对人体和环境安全，不含毒素和特异性病毒； 可大规模发酵，工艺简单而成熟，成本低廉。 一、酵母细胞表达系统 （一）表达载体 （二）表达宿主 （一）表达载体 DNA复制起始区 选择标记(SUP4) ：营养缺陷型和显性选择（抗药） 有丝分裂稳定区 整合介导区：同源重组，决定整合位置和拷贝数 表达盒：转录启动子、终止子、分泌信号序列 4.整合介导区 一段同源性DNA序列 三、酵母基因表达系统宿主菌 （二）表达宿主 二、昆虫细胞表达系统 启动子：杆状病毒多角体蛋白基因强启动子 表达系统 杆状病毒表达系统 家蚕表达系统 宿主：600多种昆虫细胞 克隆基因方法： 转移载体→共转染→同源重组→空斑筛选→纯化→重组病毒 将目的基因克隆至转移载体，使其处于多角体基因启动子的控制之下。 重组转移载体与野生型病毒DNA共转染昆虫细胞，目的基因通过细胞内同源重组而插入病毒基因组中。 利用空斑形态的差异进行筛选、纯化重组病毒，再以纯化的重组病毒感染昆虫细胞，即可获得大量的外源基因表达产物。 杆状病毒表达系统优点 容量大：能插入12kb的外源基因 高表达：polh基因启动子是目前所知的最强的真核启动子。 高效 安全 具加工修饰功能 家蚕易饲养 不足：非连续性表达；表达产物的糖基化相对简单，多不分支 。 三、哺乳动物细胞表达系统 （一）表达载体：游离、整合 （二）表达宿主 （一）表达载体 病毒载体 穿梭载体—表达质粒 扩增系统（246页） 基因扩增是外源基因在哺乳动物细胞内高效稳定表达的一种特殊方式。氨甲喋呤（MTX）是动物细胞中的关键代谢酶二氢叶酸还原酶（DHFR）的特异性抑制剂，细胞培养物经MTX处理后，绝大多数细胞死亡，但在极少数幸存下来的抗性细胞中，dhfr基因均得以扩增。 扩增系统 这些抗性细胞正是通过增加相关基因的拷贝数、提高关键代谢酶的表达水平，从而抵消MTX的抑制效应。更重要的是，扩增的区域远远大于dhfr基因本身，即与dhfr基因相邻的DNA区域同时被扩增。 DHFR-MTX高效表达系统 病毒载体Stop here! 猴多瘤病毒DNA（SV40） SV40 DNA-质粒DNA杂合载体的构建 猴多瘤病毒DNA（SV40） SV40 DNA-质粒DNA杂合载体的构建 重组的SV40 DNA分子必须经过包装后才具有感染能力，因此插入的外源DNA片段不能太大。为了尽量提高SV40的装载量，必须删除一些基因片段，因此重组的SV40分子必须与野生型病毒共感染受体细胞，才能形成有感染力的重组病毒颗粒。 猴多瘤病毒DNA（SV40） SV40 DNA-质粒DNA杂合载体的构建 pV2-GPT是一种SV40 DNA与大肠杆菌质粒DNA杂合的载体，其中gpt为细菌来源的谷氨酸-丙氨酸转氨酶基因，用于筛选重组子。该载体曾被成功地用于在猴肾细胞中表达有生物活性的兔β-珠蛋白。 猴多瘤病毒DNA（SV40） SV40 DNA载体的特点 基因表达好 外源基因能高效表达 基因重排高 病毒基因组和重组分子常发生重排和缺失现象 宿主范围窄 只能转染猴细胞 装载量较小 人乳多瘤病毒DNA 人乳多瘤病毒的生物学特性 人乳多瘤病毒（BKV）属于乳多瘤病毒科乳头瘤病毒属，其基因组为双链DNA，感染宿主