药学分子生物学（唐晓波）第五节 重组基因工.pptVIP

第五节 重组基因工程药物 重组基因工程药物生产技术包括： 上游技术 下游技术 上游技术 载体+细胞 技术：重组；导入；筛选；表达。 原核、真核、转基因动、植物。 下游技术 工程细胞、大规模高密度培养、高效表达；产物分离纯化。 一、重组人胰岛素及其突变体 （一）概述 胰岛素作用机理：胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素，也是唯一同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成的激素。作用机理属于受体酪氨酸激酶机制。 人工合成胰岛素的必要性 胰岛素这类活性蛋白多肽和细胞因子居有高度生物活性，分子量很大，立体结构异常复杂，体外难以人工合成。所以过去糖尿病患者只能服用从牛、猪体中提取的胰岛素来治疗；但牛、猪胰岛素结构上与人胰岛素有差别，如与猪胰岛素B链第30个基酸残基不同，长期服用会引起肾和眼的疾病，故必需要用基因工程方法获得重组人胰岛素进行治疗。 胰岛素结构 胰岛素由A、B两个肽链组成。人胰岛素A链有11种21个氨基酸，B链有15种30个氨基酸，共26种51个氨基酸组成。其中A7(Cys)-B7(Cys)、A20(Cys)-B19(Cys)四个半胱氨酸中的巯基形成两个二硫键，使A、B两链连接起来。此外A链中A6(Cys)与A11(Cys)之间也存在一个二硫键。 胰岛素的分类 动物胰岛素：猪和牛胰岛素，易产生抗体。 半合成人胰岛素：将猪胰岛素第30位丙氨酸，置换成与人胰岛素相同的苏氨酸，即为半合成人胰岛素。 生物合成人胰岛素 （二）制备方法 基因工程制备胰岛素 1.提取目的基因 2.提取质粒 3.基因重组 4.将质粒送回大肠杆菌 5.胰岛素的产生 (2)人胰岛素的生产方法 A. 化学合成法制人胰岛素 B. 化学转型法制人胰岛素 C. 基因工程法制人胰岛素 二、重组人凝血因子Ⅷ （一）概述 血友病是一组遗传性凝血因子缺乏引起的出血性疾病。 80%是血友病A型，由于凝血因子Ⅷ（F Ⅷ）缺乏引起。典型血友病患者常自幼年发病、自发或轻度外伤后出现凝血功能障碍，出血不能自发停止。补充凝血因子Ⅷ是临床治疗A型血友病的最主要途径。 （二）制备方法 由于F Ⅷ分子量大、二硫键多、是糖蛋白，原核、酵母等表达系统不行。应该用哺乳动物细胞表达系统。 仓鼠肾细胞系、CHO、3T3。 利用哺乳动物工程细胞生产人F Ⅷ F Ⅷ编码基因的缺陷与血友病密切相关。多年来，血友病病人都是使用从人血中分离纯化的F Ⅷ生物制品进行治疗，然而由于人的血源污染乙肝病毒或爱滋病病毒，数千名使用这种血液制品的血友病人惨遭感染，其中10%的病人最终死于爱滋病而非血友病。 利用哺乳动物工程细胞生产人F Ⅷ 早在上述情况发生之前，人F Ⅷ的cDNA便已被克隆和鉴定，血源的污染则加速了利用基因工程技术生产该药物的进程。与tPA相似，人F Ⅷ也是一种结构复杂的大分子，必须通过重组哺乳动物细胞生产，但目前商品化了的重组人F Ⅷ尚不能满足几代血友病人的大量需求。 三、重组人尿激酶与尿激酶原 （一）概述 尿激酶是一种纤溶酶原激活剂，由肾小管上皮细胞产生并被分泌到尿中，主要存在于人及哺乳动物的尿液中。尿激酶原是尿激酶的前体。 尿激酶和尿激酶原都是溶栓药物。 （二）制备方法 大肠杆菌表达 毕赤酵母 杆状病毒 CHO等 四、重组人生长激素 （一）概述 生长激素是促进机体生长和代谢所必须的一种蛋白类激素。最早是从牛和猪的脑垂体提取分离的。在临床上，它对生长激素分泌不足所引起的矮小症具有疗效。 （二）制备方法 大肠杆菌 芽孢杆菌表达系统 酵母菌表达系统 昆虫细胞表达系统 哺乳动物细胞表达系统 * 胰岛素立体结构 (1)胰岛素的结构及其生物合成 1.1人胰岛素工程菌的组建 a. A链和B链分别表达法： 由于A链和B链上共存在六个半胱氨酸残基，体外二硫键的正确配对率较低，通常只有10%－20%,采用这条工艺路线生产的重组人胰岛素每克成本高达100美元以上。 b.人胰岛素A链和B链同时表达法： c.人胰岛素原表达法： 由于C肽的存在，胰岛素原能形成良好的空间构象，三对二硫键的正确配对率也相应提高，折叠率高达80%以上，每克最终产品的成本仅50美元。 * * * 动物胰岛素：从猪和牛的胰腺中提取，两者药效相同，但与人胰岛素相比，猪胰岛素中有1个AA不同，牛胰岛素中有3个AA不同，因而易产生抗体。 半合成人胰岛素：将猪胰岛素第30位丙氨酸，置换成与人胰岛素相同的苏氨酸，即为半合成人胰岛素。 生物合成人胰岛素：利用生物工程技术，获得的高纯度的生物合成人胰岛素，其氨基酸排列顺序及生物活性与人体本身的胰岛素完全相同。 重组人组织纤维蛋白溶酶原激活剂(rt-PA)