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实验五 DNA的琼脂糖凝胶电泳紫外吸收法测定核酸的含量 【实验预习】 凝胶电泳分为哪几种？ 在常规的电泳缓冲液中（pH约8.5），核酸分子带——电，在电场中向——极移动？ 什么是琼脂糖，它随温度有怎样的变化？ 影响核酸分子的迁移率的因素有哪些？ 核酸在——有特征吸收峰？蛋白质在——有特征吸收峰？ 【实验目的】 ? 3.学习紫外线（UV）吸收法测定核酸浓度的原理。 ? 1. 掌握琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理及其操作； ? 2.学习利用琼脂糖凝胶电泳方法测定DNA片段大小。 【实验原理】 1. 琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，基本结构是1,3连结的β-D-半乳呋喃糖和1,4连结的3,6-脱水α-L-半乳呋喃糖,在水中一般加热到90℃以上溶解，温度下降到35-40℃时形成良好的半固体状的凝胶，凝胶上具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度，这是它具有多种用途的主要特征和基础可以形成。 2. DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。 3.琼脂糖凝胶电泳对核酸的分离作用主要是依据它们的相对分子量质量及分子构型，同时与凝胶的浓度也有密切关系： 1)核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系：（1）DNA分子的大小 在凝胶中，DNA片段迁移距离（迁移率）与碱基对的对数成反比，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比较，便可测出未知片段的大小。但是当DNA分子大小超过20kb时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小，因此，就用琼脂糖凝胶电泳分离DNA时，分子大小不宜超过此值;（2）琼脂脂糖的浓度 如下表所示，不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离。 琼脂糖浓度(%) 线型DNA分子的分离范围(Kb) 0.3 5～60 0.9 0.5～7 0.6 1～20 1.2 0.9～6 0.7 0.8～10 1.5 0.2～3 0.9 0.5～7 12.0 0.1～2 2).核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系 不同构型DNA的移动速度次序为：供价闭环 DNA（covalently closed circular，cccDNA）直线DNA开环的双链环状DNA。当琼脂糖浓度太高时，环状DNA（一般为球形）不能进入胶中，相对迁移率为0（Rm=0），而同等大小的直线双链DNA（刚性棒状）则可以长轴方向前进（Rm0），由此可见，这三种构型的相对迁移率主要取决于凝胶浓度，但同时，也受到电流强度、缓冲液离子强度等的影响。 4. 核酸分子中嵌入荧光染料，如GoldView?与核酸结合后能产生很强的荧光信号，其灵敏度与EB相当，使用方法与之完全相同。在紫外透射光下双链DNA呈现绿色荧光，而且也可用于染RNA，可观察到核酸片段所在的位置。同样条件对Maker电泳，对比观察DNA，可知DNA片段的大小。如果有必要，还能够从凝胶中回收DNA谱带。 5. 核酸及其衍生物，核苷酸、核苷、嘌呤和嘧啶有吸收UV的性质，其吸收高峰在260nm波长处。核酸的摩尔消光系数（或称吸收系数）用来 表示。 为每升溶液中含有1克原子核酸磷的光吸收值（即A值）（表）。测得未知浓度核酸溶液的A260nm值，即可以计算出其中RNA或DNA的含量。该法操作简便，迅速，并对被测样品无损，用量也少。 6. 蛋白质也能吸收紫外光。通常蛋白质的吸收高峰在280nm波长处，在260nm出的吸收值仅为核酸的1/10或更低，因此对于含有微量蛋白质的核酸样品，测定误差较小。RNA的260nm与280nm吸收的比值在2.0以上；DNA的260nm与280nmx吸收的比值则在1.9左右，当样品中蛋白质含量较高时，比值下降。若样品内混在有大量的蛋白质和核苷酸等吸收紫外光的物质，应设法先除去。 【实验仪器与试剂】 DNA的琼脂糖凝胶电泳器材： 水平板电泳槽；灌胶模具及梳齿；电泳仪；微波炉；微量移液器 实验试剂 DNA样品；DNA标准分子量标记物；琼脂糖；5x电泳缓冲液（20ml 0.5mol/L EDTA PH值为8；54g Tris；27.5g 硼酸）；6x样品缓冲液；mg/ml GoldView? 紫外吸收法测定核酸的含量器材： 1. 实验教师准备的两种样品DNA A和B 2.核酸蛋白测定仪。 实验试剂 1. TE缓冲液：溶液中含有10mmol/L T