重组N乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶包涵体的体外复性研究.pdfVIP

Invitro I I IIII IIIIIII I II 啪I I 1 Y208401 N．乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶(NAOase)是一种重要的用于手性拆分的酶，具 有广泛的底物选择性，常用于多种活性氨基酸的酶法拆分。本论文针对由大肠杆 菌argE基因编码在重组菌表达的重组NAO大多以无活性的包涵体存在的问题， 采用多种复性方法实现重组N．乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶复性。研究主要内容包括： X．100、 (1)重组N．乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶包涵体变性条件：比较了Triton 乙二胺四乙酸钠(EDTA)和低浓度的变性剂等几种常用的洗涤剂，发现Triton X．100和尿素联合洗涤的方法最好，最后确定最佳洗涤液成分为：4mol／LUrea， O．5％Triton X-100，lmol／LNaCL，0．05mol／LTris—HCL，pH为7．9，用此法可以大 部分的去除杂蛋白。考察了溶解液各种成分对溶解效果的影响，确定最优溶解液 成分为：8mol／L尿素、15mmo儿13．巯基乙醇、50mmol／L Tris—HCL，pH为8．5， 此时溶解液能最有效的溶解该包涵体。在最优状态下，对重组NAO包涵体的溶 解工艺也进行了一定研究，研究发现，将19重组NAO包涵体溶于lOmL溶解液 中，溶解5小时，此时溶解效果最好。 (2)重组N．乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶包涵体稀释复性：采用稀释复性法研究 了重组N．乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶(NAO)包涵体的复性条件，如蛋白浓度、复 性液中尿素浓度、pH值、GSH浓度及GSH／GSSG比例，同时对稀释操作方式进 行了考察，得到了较为适宜的复性条件。结果表明，尿素能有效抑制复性过程中 蛋白质的聚集，随着蛋白质浓度的增加，复性效果变差。当复性缓冲液中尿素浓 度为2mol／L，GSH浓度为5 进行分批稀释复性操作，复性后重组N．乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶的活性为1．077 U／mL，比酶活达到14．943 U／rag，与可溶性表达的NAO比较复性率达到21．48％。 (3)重组N．乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶包涵体稀释复性动力学的研究：在蛋白 质变性．复性三态模型的基础上，对重组NAO包涵体稀释复性的动力学过程以及 添加L．Arg和人工分子伴侣对复性过程的影响进行了研究。研究表明，三态模型 可以很好地描述NAO的稀释复性过程，NAO在复性过程中有形成二分子聚集体 的趋势。添加小分子复性剂L．Arg不仅有助于活性态酶的形成，同时对聚集体的 形成也起到了抑制作用。通过人工分子伴侣辅助复性可以较好地抑制NAO的分 示稀释复性后比酶 比酶活达到21．273 U．mg1，复性收率达到30．591％；人工分子伴侣辅助复性后比酶活达到23．082 U·m91，复性收率达到33．192％。 (4)重组N．乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶包涵体柱上复性的研究：用DEAE Fast Flow层析柱和三缓冲体系作为复性系统对重组N．乙酰鸟氨酸脱 Sepharose mol／L 乙酰基酶包涵体进行复性实验。结果表明，4 Urea与0．5％TritonX一100联 合洗涤可以大量去除杂质；三缓冲体系能有效地实现重组N．乙酰鸟氨酸脱乙酰 基酶包涵体的柱上复性。在流速为0．5mL／min，尿素梯度为21mL，尿素终浓度 为1．8 mol／L，蛋白上