小鼠原始生殖细胞定向分化为神经样细胞的研究.docVIP

　　小鼠原始生殖细胞定向分化为神经样细胞的研究 【摘要】 目的：探讨微囊对原始生殖细胞(PGCs)定向分化为神经样细胞的诱导效果。方法：用原代PGCs经悬浮培养获取类胚体(EBs);将孕13 d胎鼠的大脑半球取出，将其中的神经干细胞(NSCs)作为包在微囊里的成分。待EBs贴壁后将含有NSCs的微囊放入其中，同时另外孔板中放入等量的EBs让其自然分化。将微囊诱导分化出的细胞进行NESTIN、NSE和GFAP免疫染色鉴定。结果：用微囊诱导定向分化为神经样细胞的比例显著高于自然分化的比例。结论：悬浮培养可使PGCs形成EBs，将EBs贴壁培养可自发分化形成内、中和外三个胚层的细胞，即上皮样细胞、成纤维样细胞和神经样细胞。通过微囊的诱导方法可以使EGs定向分化为神经样细胞。 【关键词】 原始生殖细胞;细胞分化;ethods: Took cerebra from the 13days old mouse embryos,encapsulated neuronal stem cells(NSCs) collected from the cerebra into microencapsulation. EBs(embryoid bodies) ed from the PGCs collected from13 days mouse embryos by suspension culture. The microencapsulation ore, the same amount of EBs icroencapsulation for spontaneous differentiation. The neuronal cells munohistochemical staining. Results: The rate of differentiation by microencapsulation the microencapsulation enter the culture medium and can induce the differentiation of EBs into neuronal cells effectively. 　　[KEY ouse 　　原始生殖细胞(primordial germ cells, PGCs)是一种胚胎源性干细胞，具有体外分化为各种组织的能力[1]，我们已探讨了其体外自发分化的能力，发现其分化为神经样细胞的百分比最大。为了进一步提高神经样细胞的分化率，本文将重点探讨PGCs向神经样细胞定向分化的新方法，即微囊诱导法。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　ICR小鼠。 　　1.2 方法 　　1.2.1 PGCs的分离、提取和体外培养 实验使用自配13 d胎鼠，取两侧生殖嵴，用PBS洗3次后添加0.25%胰蛋白酶消化，吹打，然后过60目细胞筛，将PGCs按2.5×106/mL的密度接种于35 mm的培养瓶中进行体外培养。 　　1.2.2 悬浮培养 (1)类胚体(embryoid bodies， EBs)的形成：取分离提取的PGCs，置于培养瓶中进行悬浮培养，培养期间每隔1～2 h摇晃1次培养瓶防止PGCs贴壁。换液方法：将含细胞的培养液放入离心管里1 000 r/min离心10 min，弃上层液体，补足培养液。(2)EBs的鉴定: 使用免疫组织化学法，对EBs进行甲胎蛋白(alpha fetoprotein， AFP)标记，将悬浮培养4 d的EBs经4%多聚甲醛固定15 min，然后用甲醇在-20℃固定5 min，5%BSA覆盖EBs，处理45 min以封闭非特异性染色。然后滴加一抗(兔抗人AFP多克隆抗体工作液购自中杉公司，ZA0008)，在4 ℃孵育过夜，继之滴加生物素化山羊抗兔IgG，最后滴加DAB显色。 　　1.2.3 微囊制作 (1)神经干细胞的提取及鉴定：①将孕13 d 胎鼠的大脑半球取出，在解剖镜下剥去软脑膜，然后将其置于预冷的含有谷氨酰胺的高糖DMEM培养液中，最后用PBS冲洗3遍，再加入0.25%胰蛋白酶于37 ℃水浴消化10 min，每3 min摇匀1次。消化完毕后将消化液吸出，然后加入培养液终止消化,吹打成单细胞悬液后放入37 ℃，5%CO2培养箱中培养。所用培养液为高糖DMEM，内添加10% FBS(Hyclone)和200 mM L谷氨酰胺(Lglutamine, LGlu)(Hyclone)和1∶1的青链霉素。②将形成的神经球放入预先用0.05%PL多聚赖氨酸(Sigma)包被的含有盖玻片的小皿中培养24 h后，使用免疫组化的方法对神经干细胞巢进行Nestin标记。(2)微囊制作：首先将含原代NSCs的培养液1 000 r/min,离心5 min