头孢拉定胶囊微生物限度检查法的验证分析.docVIP

　　头孢拉定胶囊微生物限度检查法的验证分析 【关键词】 微生物限度检查；低速离心-薄膜过滤法；平皿法 微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查［１］。我们采用常规方法对头孢拉定胶囊进行微生物限度检查时发现,不仅头孢拉定本身对细菌的强抑制作用影响实验结果，而且头孢拉定胶囊的某些辅料也对微生物限度检查法产生一定影响，不能有效地保证实验结果的准确性。我们采用了低速离心-薄膜过滤法和平皿法相结合的实验方法来进行头孢拉定胶囊微生物限度检查，取得了比较理想的实验效果。报告如下。 1 材 料 1.1 培养基及试药 营养琼脂培养基（批号：071008）、玫瑰红钠琼脂培养基（批号：070329）、改良马丁培养基（批号：061020）、改良马丁琼脂培养基（批号：060404）、胆盐乳糖培养基（批号：060913）、营养肉汤培养基（批号：061113）、MUG培养基（批号：060913）、 分析纯氯化钠(批号：070725)试剂。 1.2 菌 种 大肠埃希菌［CMCC(B)44102］、金黄色葡萄球菌［CMCC(B)26003］、枯草芽孢杆菌［CMCC(B)63501］、白色念珠菌［CMCC(B)98001］、黑曲霉［CMCC(B)98003］，均由江苏省药检所提供。 1.3 主要仪器设备 HHB11360型电热恒温培养箱（上海跃进医疗器械厂）；DG2型多功能恒温箱（上海医疗器械厂）；ZF7C型三用紫外分析仪（上海慧鑫科学仪器有限公司）；YXQ LS75SⅡ型全自动立式压力蒸汽灭菌器（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；1013A鼓风干燥箱（通州市沪通制药机械设备厂）；HTY-2000A集菌仪（杭州泰林医疗器械厂）；800型离心沉淀器（江苏江阴科研器械厂）。 1.4 样 品 头孢拉定胶囊，规格：0.25 g，批号：071003， 071113， 071201。生产单位：江苏聚荣制药集团有限公司。 2 方 法 2.1 细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证［1］ 2.1.1 供试液制备 取供试品10 g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100 ml，于45℃水浴中保温、浸泡、振摇溶化，制成1∶10的供试液。 2.1.2 菌液的制备 (1) 将大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物1白金耳分别接种至10 ml营养肉汤培养基中，30～35℃培养18～24 h，分别取上述培养物1 ml加入9 ml 0.9％的无菌氯化钠溶液内以10倍递增稀释制成每1 ml含菌数 50～100 cfu的菌悬液。(2) 将白色念珠菌的新鲜培养物1白金耳接种至10 ml 改良马丁培养基中，23～28℃培养24～48 h，取上述培养物1 ml加入9 ml 0.9％的无菌氯化钠溶液内以10倍递增稀释制成每ml含菌数50～100 cfu的菌悬液。(3)将黑曲霉的新鲜培养物接种至改良马丁琼脂斜面培养基上，23～28℃培养5～7 d，使大量孢子产生。加入0.9％无菌氯化钠溶液5 ml,用无菌玻棒轻轻将孢子洗脱，然后用一支管口包有无菌棉花且能过滤菌丝的10 ml吸管吸出孢子液至无菌试管内，用0.9％的无菌氯化钠溶液稀释再与标准比浊管比浊，其浊度与标准比浊管相当后，再逐步稀释制成每ml含孢子数 50～100 cfu的孢子悬液。 2.1.3 验证方法 本品对细菌生长有强抑制作用，药典所规定的三株验证实验用菌株：大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌对本品均较为敏感，所以本品的细菌数测定应采用薄膜过滤法。本品为胶囊剂，由于囊壳中的明胶使供试液在常温下易成凝胶状，而造成取样困难，滤膜堵塞，所以应注意操作全过程保持45℃。本制剂中含有一定量的不溶性辅料，宜采用低速离心-薄膜过滤联合应用。由于本品对真菌没有抑制作用，进行霉菌及酵母菌计数无需采用薄膜过滤法，使用常规法（平皿法）即可使白色念珠菌和黑曲霉的回收率达到要求。 2.1.3.1 细菌计数方法的验证（低速离心-薄膜过滤联合应用） （1）供试液的制备。取1∶10的供试液10 ml注入离心管中，500 r/min，离心5 min。取上清液置另一离心管中，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至10 ml。（2）试验组：用少量的稀释剂将薄膜过滤器内的滤膜湿润。取低速离心后制备的供试液1 ml加于pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100 ml中过滤，再用400 ml pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜，泵速为160转，冲洗3次后将含50～100 cfu／ml大肠埃希菌的菌悬液1 ml加入剩余的100 ml冲洗液中过滤。取出滤膜菌面朝上，贴于含2 ml β内酰胺酶营养琼脂培养基平板上，30～35℃培养48 h。对金黄色